AMPK对小鼠乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育的影响

摘要

目的：
　　5’单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是真核生物中被公认的能量调节感受器。本研究旨在构建AMPK dominant negative转基因小鼠，观察AMPK活性抑制后对乳腺上皮细胞增殖及乳腺发育的影响，观察AMPK激活剂二甲双胍对乳腺发育的作用，探究是否有恶性化肿瘤的形成。
　　方法：
　　1.利用外源性α-flag修饰AMPK突变片段构建AMPK dominant negative转基因鼠（以下简称DN），采用PCR及免疫组化的方法检测靶基因和蛋白的表达以检测转基因鼠的构建成功。
　　2.采用Whole Mount的方法，观察比较4~30不同周龄、妊娠期5 d/10 d/17 d及哺乳期2 d DN和WT雌鼠乳腺全组织形态的变化情况；并通过HE以及PCNA染色进一步观察AMPK活性降低对小鼠乳腺上皮细胞结构及增殖的影响。
　　3.用5 mg/ml浓度二甲双胍腹腔注射4周龄、妊娠期5天和10天WT小鼠7天，Whole mount观察青春期导管的形态学变化。
　　结果：
　　1. RT-PCR鉴定AMPK DN基因型，目的条带为500bp。利用Q-PCR检测α-flag片段在小鼠乳腺中基因RNA水平的表达，显示WT中并无表达。另外，免疫组化进一步证实α-flag蛋白在DN小鼠上皮细胞中表达，且p-AMPK表达下降，提示转基因鼠的构建成功。
　　2.青春期，AMPK活性降低对小鼠乳腺导管的延伸和扩展进程无显著变化，然而，5w DN小鼠中导管终端TEB逐渐增多，较WT小鼠差异有统计意义；5w、6w时，TEB面积均较WT组大，p<0.05，其差异具有统计学意义；同时，HE及PCNA显示促进成熟导管上皮的细胞增殖及增厚。妊娠期，DN和WT组乳腺发育无明显区别，哺乳期DN小鼠腺泡内腔大于WT小鼠，p<0.05，其差异具有统计学意义。
　　3.形态学上，二甲双胍能抑制妊娠期初期乳腺导管发育。
　　结论：
　　AMPK dominant negative（DN）转基因鼠成功构建；小鼠乳腺上皮AMPK活性降低促进青春期小鼠导管上皮细胞的增殖，促进TEBs的发育，对妊娠期乳腺发育无明显变化，二甲双胍抑制妊娠期初期导管发育；AMPK活性变化能影响小鼠乳腺的阶段发育。

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中英文缩略词对照表

第1章 引言

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 AMPK乳腺特异性突变小鼠的构建及鉴定

3.1 实验目的

3.2 实验结果

第4章 AMPK DN对小鼠乳腺生长发育的影响

4.1 实验目的

4.2 实验结果

第5章 AMPK DN对小鼠妊娠期乳腺发育的影响

5.1 研究目的

5.2 实验结果

第6章 二甲双胍对WT小鼠青春期及妊娠期乳腺发育的形态学研究

6.1 研究目的

6.2 实验结果

第7章 讨论

7.1 AMPK DN转基因鼠的构建

7.2 AMPK调节乳腺发育

7.3 二甲双胍、乳腺发育及肿瘤形成

第8章 结论

附录

致谢

参考文献

攻读学位期间的科研成果

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