前凋亡蛋白Bim调控心肌缺血再灌注损伤中自噬及凋亡的机制研究

摘要

目的：
　　心肌缺血再灌注（I/R）损伤时过度自噬促发凋亡，前凋亡蛋白Bim是自噬与凋亡对话的交点。本团队新近发现心肌细胞缺氧时凋亡增加伴随Bim表达升高。我们推测：心肌I/R损伤时发生过度自噬，通过上调Bim表达而促发凋亡。本实验通过自噬抑制剂干预，观察心肌I/R损伤时过度自噬促发凋亡的作用,探讨Bim与自噬和凋亡的关系。研究结果有望揭示心肌I/R损伤时Bim介导自噬与凋亡对话机制，为防治心肌I/R损伤提供新思路。
　　方法：
　　培养乳鼠心肌细胞，建立缺氧复氧（H/R）模型，在复氧时加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤10mM(3-MA）、氯喹20μM(CQ)干预。实验分为四组：正常组(control)、H/R组、H/R+3-MA组、H/R+CQ组,探讨Bim与凋亡和自噬的关系。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测心肌细胞存活率，分光光度法测定乳酸脱氢酶（LDH）水平，流式细胞仪检测细胞凋亡率；Real-time PCR检测Bim、LC3、Beclin1 mRNA表达水平；Weston-blot检测凋亡相关蛋白Bim、active caspase-3、CytC及自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达。
　　结果：
　　缺氧复氧组与正常组对比，LDH及凋亡率升高,细胞成活率下降；Bim、LC3、Beclin1 mRNA表达量升高（p<0.01）；缺氧复氧组Bim、active caspase3、CytC、LC3、Beclin蛋白表达量升高。而加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤、氯喹处理后与缺氧复氧组相比，加药组LDH及凋亡率也下降,细胞成活率增加（p<0.01）；Bim、Beclin1 mRNA表达量下降；Bim、active caspase3、CytC、Beclin1蛋白表达量下降。H/R+3-MA组、H/R+CQ组与缺氧复氧组对比，H/R+3-MA组LC3mRNA及蛋白表达量下降（p<0.01），而CQ组LC3蛋白及mRNA表达量升高（p<0.01）。结论：
　　Bim参与缺氧复氧对心肌细胞的损伤，通过抑制过度自噬，Bim表达下调，减少细胞凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤。再灌注导致过度自噬，过度自噬引起细胞凋亡增加，Bim表达上调。Bim可能是凋亡与自噬相互联系的桥梁。

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中英文缩略词

第1章 前言

第2章 材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3 统计学方法

第3章结果

3.1原代心肌细胞存活率检测

3.2原代心肌细胞形态学观察

3.3心肌细胞活力测定

3.4原代心肌细胞纯度的鉴定

3.5体外心肌细胞建立缺氧复氧模型及自噬状态的检测

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果及荣誉

综述: 自噬与血管疾病的相关研究*