利用体细胞核移植技术构建先天性肾病综合征克隆猪模型

摘要

目的：
　　先天性肾病综合征（Congenital Nephrotic Syndrome，CNS）（芬兰型）的特点为：罹患者在出生后约3个月内表现出典型肾病综合征的表现。大多数情况下，罹患该病的儿童在宫内期间即存在症状，表现为新生儿低体重，可以在很短的时间内迅速恶化至肾小球硬化阶段，传统的激素及免疫抑制治疗无效，大多患者在出生后6个月左右因严重并发症而死亡。该病的致病基因是NPHS1（位于人类19号染色体长臂13.1位置）。实验用小型猪作为一种与人类在病理及病生上高度近似的动物，具有很高的疾病建模价值。类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALENs）作为多类物种当中通用的基因敲除技术，可以对猪胎儿成纤维细胞进行精确基因修饰。“体细胞核移植技术”（somatic-cell-nuclear transfer，SCNT）是指：将哺乳动物的“早期胚胎细胞（early embryonic cells）”亦或“体细胞”胞核人工移进“去核后（denucleate）”的受精卵或卵母细胞中，最终娩出的子代个体的基因型和供体细胞相同，这个过程又称为“克隆（Clone）”或无性繁殖（asexual reproduction）。本实验我们利用由 TALENs技术所获得的基因修饰细胞（NPHS1双等位基因敲除猪胎成纤维细胞）充当克隆的供体核来源，借助SCNT创制NPHS1—/—先天性肾病综合征克隆猪，为今后相关研究提供疾病动物模型。
　　方法：
　　1)采用“金门法（Golden Gate）”构建针对NPHS1外显子2（exon2）的TALENs载体，再用“电击核转染法”将TALEN质粒及抗性筛选质粒转染小型猪原代成纤维细胞（Porcine primary fibroblasts，PPF）得到NPHS1—/—细胞。
　　2)以此NPHS1基因修饰猪胎成纤维细胞作为供体（复苏后培养并悬液化），配合猪卵母细胞体外成熟过程。
　　3)采用“盲吸法（Blind Aspiration method）”，弃除卵的胞核，分批卵周隙注射 NPHS1—/—细胞。
　　4)利用“电脉冲-刺激法（electric pulse stimulation）”，将上一步得到的“重构胚”进行融合操作。
　　5)体视镜下观察检查，判断供体细胞是否已与卵母细胞有效融合，挑弃未融合的重构胚并统计融合率（胚胎融合的同时即激活）。
　　6)进行短期体外胚胎培养（In vitro embryoculture），手术方法将胚胎移植进代孕受体母猪。
　　7)维持代孕母猪115±2天的妊娠，期间超声判断受孕情况。
　　8)克隆仔猪娩出后组织取材，提出仔猪基因组，利用PCR-测序方法鉴定阳性克隆仔猪。
　　结果：
　　1)TALEN打靶后筛选得到NPHS1—/—细胞。
　　2)分批卵周隙注射NPHS1—/—细胞，每批重构胚均融合良好。
　　3)选取部分陆续做手术胚胎移植，累计移植代孕受体母猪5头，成功移入胚胎分别为470、460、410、380、370枚，且30d超声诊断其中怀孕3头，统计受孕率达60％。
　　4)其中2头孕受体在约孕90d左右发生胚胎退化吸收，另1头于孕117d产下1头克隆仔猪。克隆仔猪身长、体量均与自然猪相仿，体温也波动在同类正常范围内、觅乳正常，活动能力与同类相仿，表现出了较好地外界适应能力。
　　5)克隆仔猪取材组织并提取基因组PCR-测序方法鉴定为野生型（wild type，WT）。
　　结论：
　　笔者采用TALENs基因打靶和电击核转染技术（Electric nuclear transfection）成功筛选获得NPHS1”双等位基因敲除”PPF，证实由TALEN敲除的猪胎成纤维细胞能够较好地经受体外筛选的压力。笔者挑选NPHS1基因敲除供体细胞成功注射到去核卵母细胞的卵周隙，重构胚胎融合/激活后获得了较高的融合率，证实了本实验中所采用的相关方法及参数具有可行性，能够得到稳定的克隆结果；也证实了TALEN得到的基因修饰细胞经历体外筛选压力，完全能够满意地作为核移植的供体细胞来源。笔者成功利用胚胎移植手术，代孕受体母猪前期受孕率达到了60%的水平，“NPHS1打靶克隆”胚胎移植与“自然克隆”的前期受孕率处在同一水平，证明本实验所采用的核移植技术路线及操作参数具有可行性。也证实TALEN打靶的PPF细胞充当核移植供体细胞，具备充分的“重编程（reprogramming）”能力而获得较高的受孕率。本实验虽然获得了克隆猪，经鉴定只获得了WT野生型，此次克隆未能够成功获得NPHS1基因敲除猪，未成功构建先天性肾病综合征模型，有待于再次体细胞核移植。

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第1章 引言

1.1 先天性肾病综合征（芬兰型）概述

1.2 利用基因修饰猪作为疾病模型的优势

1.3 猪体细胞核移植技术概况

1.4 猪基因修饰与核移植技术的结合

1.5 研究背景及立题依据

第2章 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 供体细胞

2.3 主要试剂

2.4 主要溶液的配制

2.5 仪器与耗材

2.6 实验方法

2.7 统计学分析

第3章 结 果

3.1 TALEN基因修饰成纤维细胞结果

3.2 基因修饰阳性细胞复苏及培养结果

3.3 重构胚胎及其融合结果

3.4 胚胎移植手术情况及结果

3.5 妊振B超判断结果

3.6 克隆猪基因组提取及PCR测序鉴定结果

第4章 讨 论

4.1关于共转染筛选中假阳性的讨论

4.2 探讨SCNT技术总体存在的不足

4.3 于卵母细胞及其影响因素的讨论

4.4关于供体细胞及其影响因素的讨论

4.5关于PPF移入去核卵母细胞的讨论

4.6 关于重构胚激活操作的讨论

4.7关于胚胎移植及其影响因素的讨论

4.8关于受体妊娠及其维持的讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望及进一步工作的方向

致谢

攻读学位期间的研究成果

参考文献

综述: 基因修饰猪构建方法现状