体细胞核移植技术生产克隆猪及转基因猪程序的研究

摘要

体细胞核移植技术已广泛应用于动物农业和医学领域，体细胞克隆包括许多环节，影响克隆效率的包括很多重要因素，如受体卵母细胞的去核，以及重构胚的表观遗传修饰，另外转基因与非转基因细胞作为供体细胞也受到很大的争议。本实验尝试从对化学辅助去核方法（Demecolcine处理）的深入探究，组蛋白去乙酰化抑制剂（CUDC-101）对表观遗传的修饰及转基因（IFN-γ，scFv，IS）与非转基因细胞进行体细胞核移植生产克隆猪及转基因猪三方面着手，进一步对体细胞核移植生产克隆猪及转基因猪的操作程序进行研究。
　　实验一：Demecolcine（DEM）是一种微管破坏剂，在许多物种中已广泛应用于M II卵母细胞的去核，然而，目前没有报道探究这种方法对猪卵母细胞中细胞成熟促进因子（MPF）分布的影响。
　　（1）本实验探究了不同DEM处理时间对猪卵母细胞成熟后MPF活性的影响。DEM处理猪卵母细胞0.5h、1h、2h、3h后MPF活性均高于对照组，在处理1h后MPF活性达到最高值，因此确定1h处理时间为DEME的最佳处理时间。
　　（2）探究了DEM处理对猪卵母细胞去核后MPF及其亚基Cyclin B1的分布影响。我们分析了DEM处理后MPF水平和Cyclin B1在猪卵母细胞中的分布。我们证明了经卵母细胞处理0.4μg/ml DEM1h影响了MPF的分布，使MPF的分布发生改变，集中于细胞质中，从而提高去核后细胞质内MPF浓度，极大限度的保留了MⅡ期卵母细胞MPF活性；免疫荧光染色观察MPF的调解亚基Cyclin B1，DEM处理组中纺锤体微管被破坏并诱导染色质凝集，Cyclin B1较为均匀的分布于整个卵母细胞内，导致MPF水平升高。
　　（3）比较了化学辅助去核法和机械去核法去核效率及细胞质中MPF含量的比较。分别采用化学辅助去核和机械去核法去除猪卵母细胞细胞核，对去核前后卵母细胞MPF水平进行检测，发现化学辅助去核法对卵母细胞MPF水平未有改变，而机械去核法使MPF水平降低。去核后注入五指山小型猪耳皮细胞，对重构胚进行培养，发现化学辅助去核法的去核率及注核后细胞的发育，囊胚率均高于普通机械去核法，2-4细胞发育率分别为80.6％、78.8%，囊胚率分别为16.3%、14.1%，差异并不显著。体内发育实验验证化学辅助去核法优于机械去核组。这为理解化学辅助去核方法提供理论根据。
　　实验二：体细胞核移植技术生产的克隆动物其成功率低，这与表观遗传异常有一定关联，这其中就包括组蛋白乙酰化的异常。通过组蛋白去乙酰化抑制剂，可以改变表观遗传状态，从而进一步提高体细胞克隆胚胎的发育潜能。CUDC-101已经有研究证明这种去乙酰化抑制剂可以提高组蛋白乙酰化水平，但是在体细胞克隆胚胎方面至今还未有人使用。本研究是使用CUDC-101探究其对猪体细胞核移植胚胎的影响。利用不同浓度的组蛋白去乙酰化抑制剂 CUDC-101处理猪体细胞克隆胚胎24 h，寻找最适合浓度，随后用最适浓度处理不同时间。确定好最佳时间和最佳浓度后，将胚胎通过胚胎移植移入代孕母猪体内，观察其妊娠情况。结果：在体外发育的胚胎给予不同浓度的CUDC-101处理，观察各浓度对于胚胎发育能力的影响。结果显示，经1μM的CUDC-101处理24h的胚胎与对照组以及0.5，10μM处理组相比，其囊胚率明显提高，分别为18.1%，9.9%，8.1%和0.0%（P<0.05）。用1μM的CUDC-101处理重构胚不同的时间，并在处理后激活胚胎。结果可知，经24 h处理的胚胎，囊胚率高于其他组别。对CUDC-101处理的胚胎以及未经处理胚胎进行胚胎移植，移植到代孕母猪体内。综上所述，CUDC-101均可以显著提高猪SCNT胚胎体内及体外核重编程的发育能力。
　　实验三：通过体细胞克隆方法生产转基因动物已经成为一种新方法，在本实验中，我们评估了通过体细胞核移植生产转基因猪的效率，供体细胞采自2岁雌性五指山小型猪耳皮细胞，细胞分别转染三种不同抗病基因，分别为转染猪γ干扰素（IFN-γ）基因，抗口蹄疫病毒单链抗体基因（scFv）、猪IFN-γ及抗口蹄疫病毒scFv融合基因(IS)，与非转基因细胞比较，作为供体细胞用于体细胞克隆。
　　结果：
　　（1）我们评估了当转基因细胞与非转基因细胞分别作为供体时的胚胎的发育潜能，在卵裂率无显著差异，分别为78.4%，79.5%，79.7%和80.6%，在随后囊胚率上也无显著差异，分别为10.8%，12.0%，11.4%和16.2%。
　　（2）将转有3种不同基因及非转基因组的重构胚分别被移植到27头代孕母猪体内，其中19头在胚胎移植后24-26天B超检查中表现为妊娠，最终11头代孕母猪分娩生产下67头仔猪，仔猪出生一周后有25头死亡，最终我们获得了49头存活克隆仔猪。经比较，转基因组与非转基因组在克隆仔猪成活率上并未有显著性差异，分别为57.1%，52.6%，50.0%和66.6%（P<0.05）。经PCR基因分析，6头表现为转基因阳性。其中，5头为scFv基因阳性，1头为IFN-γ基因阳性。结论， 我们成功生产出转有IFN-γ和scFv基因的克隆五指山小型猪，与非转基因克隆猪相比较，在卵裂率、囊胚率及产子率上均无显著性差异，因此通过体细胞克隆方法可以作为生产转基因猪的方法，并且不因为是转基因动物而降低生产效率。

目录

声明

ABBREVIATIONS

CHAPTER 1 RESEARCH BACKGROUND

1.1 Somatic cell nuclear transfer \(SCNT\)

1.2 Dolly the sheep

1.3 Cloning domestic animals from somatic cells

1.4 The role of MPF meiotic maturation of oocyte

1.5 Enucleation of the recipient oocyte

1.6 Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer

1.7 Production of transgenic pigs

1.8 Aim of this study

CHAPTER 2 EFFECT OF DEMECOLCINE-ASSISTED ENUCLEATION ON MPF LEVELS AND CYCLIN B1 DISTRIBUTION IN PORCINE OOCYTES

2.1 Introduction

2.2 Materials and Methods

2.3 Results

2.4 Discussion

CHAPTER 3 EFFECT OF CUDC-101 TREATMENT AFTER SOMATIC CELL NUCLEAR TRANSFER ON DEVELOPMENT OF PIG EMBRYOS

3.1 Introduction

3.2 Materials and methods

3.3 Results

3.4 Discussion

CHAPTER 4 PRODUCTION OF TRANSGENIC MINIATURE PIGLETS BY TRANSFER OF IFN-γ,SCFV AND IS GENE TRANSFECTED SOMATIC CELLS INTO ENUCLEATED OOCYTES

4.1 Introduction

4.2 Materials and Methods

4.3 Results

4.4 Discussion

致谢

参考文献

PUBLICATION