构建M23-AQP4稳定表达的HEK293细胞应用于血清抗AQP4抗体检测的研究

摘要

目的：构建M23-AQP4稳定表达HEK293细胞，并以此细胞为底物，采用细胞间接免疫荧光法（CBA）检测血清标本抗AQP4抗体。观察不同温度保存对M23-AQP4稳定表达HEK293细胞和血清标本抗AQP4抗体的影响，探索一种简便易行的血清抗AQP4抗体检测方法，以利于血清抗AQP4抗体检测的临床推广。
　　方法：将pEGFP-N1-M23-AQP4质粒通过磷酸钙转染试剂转染接种于6孔细胞培养板的HEK293细胞，在荧光显微镜下观察并选择瞬时转染率高的细胞培养孔，用含G418的筛选培养液筛选并挑单克隆细胞进行培养扩增，获得绿色荧光稳定表达的单克隆细胞，并以此细胞为底物，采用CBA法检测M23-AQP4表达及分布，以鉴定获得绿色荧光稳定表达的单克隆细胞是否为M23-AQP4稳定表达细胞。经鉴定M23-AQP4稳定表达HEK293细胞构建成功后，以其作为底物，采用CBA法检测7例视神经脊髓炎（NMO）、24例多发性硬化（MS）、41例其他脱髓鞘性疾病（视神经炎、脊髓炎、脱髓鞘性脑病、吉兰-巴雷综合征）以及30例非脱髓鞘性疾病患者血清抗AQP4抗体及其滴度，并比较4组患者血清抗AQP4抗体阳性率。M23-AQP4稳定表达HEK293细胞接种于96孔细胞培养板并经4％多聚甲醛固定，于室温、4℃、-20℃4周保存，并分别作为底物再次检测经首次检测为抗AQP4抗体阳性的血清标本及随机选取的相等数量的阴性血清标本的抗AQP4抗体及滴度，并比较其抗AQP4抗体阳性率和抗体滴度与首次检测结果是否存在差异。经首次检测为抗AQP4抗体阳性的血清标本及随机选取的相等数量的抗AQP4抗体阴性血清标本反复冻融3次后于室温、4℃、-20℃1周保存，以新鲜制备的M23-AQP4稳定表达HEK293细胞为底物，采用CBA法分别检测上述血清标本抗AQP4抗体及其滴度，并比较其检测结果与首次检测结果是否存在差异。
　　结果：经CBA法检测鉴定表明绿色荧光稳定表达的单克隆细胞即为M23-AQP4稳定表达细胞，M23-AQP4稳定表达HEK293细胞构建成功，检测显示M23-AQP4主要表达在细胞膜上。本研究基于M23-AQP4稳定表达HEK293细胞的CBA法检测血清抗AQP4抗体，结果显示NMO阳性率达85.7%（6/7），显著高于多发性硬化（MS）4.2%（1/24）及其他脱髓鞘性疾病2.4%（1/41）和非脱髓鞘性疾病0.0%（0/30）（均 P<0.01），其诊断 NMO的敏感性为85.7%（6/7），以MS作为对照时，其诊断NMO的特异性为95.8%（23/24），以非NMO的脱髓鞘疾病作为对照时，其诊断NMO的特异性为96.9%（63/65），以非脱髓鞘疾病作为对照时，其诊断NMO的特异性为100%（30/30）。M23-AQP4稳定表达HEK293细胞于室温、4℃、-20℃三种温度保存4周后分别用于血清标本抗AQP4抗体检测，其抗AQP4抗体检出率和抗AQP4抗体滴度值与首次检测结果一致。血清标本于室温、4℃、-20℃三种温度保存1周后，采用以新鲜制备的M23-AQP4稳定表达HEK293细胞为底物的CBA法分别进行抗AQP4抗体检测，结果显示4℃以下保存的血清标本其抗AQP4抗体检出率和抗体滴度值与首次检测结果一致；室温条件下保存的血清标本其抗AQP4抗体检出率与首次检测一致，但抗AQP4抗体滴度值显著低于首次检测所得的抗体滴度值（P<0.01）。
　　结论：成功构建M23-AQP4稳定表达HEK293细胞。NMO患者血清中广泛存抗AQP4抗体，抗AQP4抗体可作为NMO的可靠生物学标志。本研究方法检测抗AQP4抗体对NMO的敏感性和特异性较高，可用于辅助NMO的临床诊断及鉴别。M23-AQP4稳定表达HEK293细胞和血清抗AQP4抗体稳定性较好，本研究方法简便易行，有助于抗AQP4抗体检测的临床推广。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 对象和方法

2.1 主要试剂

2.2 实验设备

2.3 观察对象

2.4实验方法

2.5 统计学处理

第3章 结果

3.1 M23-AQP4稳定表达HEK293细胞构建

3.2 血清抗AQP4抗体检测

3.3 M23-AQP4稳定表达HEK293细胞稳定性检测

3.4血清抗AQP4抗体稳定性检测

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述: 抗水通道蛋白4抗体与中枢神经脱髓鞘性神经免疫性疾病