17-β雌二醇抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的作用机制研究

摘要

目的：
　　采用白细胞介素1β(interIeukin-1β IL-1β)建立软骨细胞凋亡模型,研究17-β雌二醇在其中的作用机制。
　　方法：
　　体外分离培养鼠关节软骨细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态变化，甲苯胺蓝染色及 II胶原蛋白免疫组化染色鉴定原代培养细胞为软骨细胞。实验分为对照组、IL-1β作用组、系列浓度的17-β雌二醇组（系列浓度的17-β雌二醇+50ng/mlrrIL-1β）及雌激素受体阻滞剂组（17-β雌二醇+ICI182780+50ng/mlrrIL-1β），CCK-8发测定细胞存活率,配制不同浓度17-β雌二醇，细胞计数试剂盒8（cell counting kit8，CCK-8）检测不同浓度17-β雌二醇对软骨细胞增殖的影响。Annexin V-FITC/PI荧光染色观察各组细胞凋亡，采用RT-PCR方法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、MMP3及MMP13mRNA表达水平；Western blotting方法检测MMP3、MMP13蛋白的表达水平
　　结果：
　　分离培养的SD大鼠软骨细胞在倒置相差显微镜下观察大多呈多角形，具有丰富的胞质，细胞核位于胞体中心，少数可有多个核仁，原代软骨细胞培养10天左右达到融合状态。正常软骨细胞经甲苯胺蓝染色能使细胞胞浆呈蓝色，细胞核呈紫蓝色，大多数为圆形或椭圆形，可见多个核仁。CCK-8检测结果发现：与对照组相比, IL-1β组仅有约40％的生存率，细胞明显减少。与IL-1β组相比，17β-E2+ IL-1β组细胞存活率显著增加,并呈剂量依赖性。IL-1β组和17β-E2+IL-1β+ICI组之间细胞存活率没有明显变化。通过Annexin V-FITC和PI双标荧光染色显示 IL-1β诱导组软骨细胞凋亡比例较3组不同浓度17β-E2(10-7 M，10-9M,10-11M)+IL-1β组均高。17β-E2+IL-1β+ICI组与IL-1β诱导组相比无显著差别。RT-PCR方法检测凋亡相关基因，与对照组比较， IL-1β诱导后，细胞Bax表达升高， Bcl-2表达降低，差异具有统计学意义。3组浓度的17β-E2均具有抑制 IL-1β上调 Bax表达的作用，与IL-1β组和17β-E2+IL-1β+ICI组比较差异均具有统计学意义。Western blotting检测发现 B组细胞的 MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明显大于A和 C组( P＜0.05)，并且D组的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明显大于A和 C组( P＜0.05)。
　　结论：
　　（1）IL-1β能成功诱导关节软骨细胞凋亡，可以用来模拟体内骨关节炎软骨损害的体外模型
　　（2）17-β雌二醇能抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，并且抑制效果成剂量依赖性。
　　（3）17-β雌二醇是通过下调MMP-3、MMP-13的表达抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1细胞来源

2.1.2 主要试剂及耗材

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 器材的准备

2.2.2 软骨细胞原代分离培养

2.2.3 软骨细胞传代培养及鉴定

2.2.4 CCK-8法检测细胞存活率

2.2.5 Annexin V-FITC/PI荧光染色观察各组细胞凋亡

2.2.6 RT-PCR 检测Bax， Bcl-2 及MMP3，MMP13mRNA表达

2.2.7Western-blot检测MMP3，MMP13蛋白表达

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 软骨细胞的形态及鉴定

3.2 CCK-8发测定细胞存活率

3.3Annexin V-FITC/PI荧光染色观察各组细胞凋亡

3.4 RT-PCR检测各组细胞Bax，Bcl-2,MMP3,MMP13mRNA表达情况

3.5western blot检测各组细胞MMP3,MMP13蛋白表达情况

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:雌激素在软骨中作用机制研究进展