耐阿霉素白血病细胞株SHI-1/ADR的建立及其耐药机制的初步研究

摘要

背景：
　　白血病是一类恶性程度较高的血液系统肿瘤，预后普遍较差，死亡率高，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率男性中占第6位，女性中占第8位。其经典治疗方案为蒽环类药物联合阿糖胞苷(cytosinearabinoside，Ara-C)，多数成年AML患者通过化疗可获得完全缓解(completeremission，CR)，但只有不到三分之一的患者可获得长期无病生存（disease-freesurvival，DFS）。治疗失败的主要原因是肿瘤细胞对传统化疗发生了多药耐药（multidrugresistance；MDR），多药耐药已成为复发难治白血病患者治疗最大的障碍。目前化疗相关MDR机制尚未完全阐明，建立白血病耐药细胞株是研究白血病耐药的基础及逆转机制的必要条件。本文以急性髓细胞白血病（M5）型细胞株SHI-1为研究模型,在构建耐药细胞株SHI-1/ADR的基础上,初步研究了该细胞株的生物学特性，探索窖蛋白-1（caveolin-1,CAV-1）及自噬在白血病发生耐药过程的作用以及探索逆转耐药的机制。
　　研究目的：
　　1、构建耐阿霉素细胞株SHI-1/ADR，研究其生物学特性；
　　2、探索窖蛋白-1及自噬参与白血病多药耐药的形成及抑制自噬联合常规化疗对耐药株的影响。
　　方法：
　　1、通过浓度递增法增加阿霉素浓度，逐步诱导SHI-1细胞对阿霉素产生耐药，最终建立耐阿霉素细胞株SHI-1/ADR；
　　2、采用瑞氏染色法观察耐药株形态学变化，CCK-8法了解细胞增殖、耐药情况，流式细胞术观察阿霉素耐药对细胞周期的影响；
　　3、实时荧光定量RT-PCR检测CAV-1、Beclin-1及MDR-1在耐药株及亲本细胞中表达情况；
　　4、通过CCK-8法了解自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)单独及联合常规常规化疗对耐药株SHI-1/ADR增殖的影响，流式细胞术了解凋亡情况；
　　结果：
　　1、通过浓度递增法历时8个月成功构建了耐阿霉素细胞株SHI-1/ADR；
　　2、SHI-1/ADR细胞形态学发生了细微的改变：细胞间隙增加，胞核噬碱性加深，胞膜周边出现少量小颗粒，细胞体积大小不均，可见不规则形细胞；CCK-8检测示：SHI-1/ADR倍增时间延长4.853小时（P＜0.05）；SHI-1/ADR细胞IC50=6.911±0.255ug/ml，SHI-1细胞IC50=0.969±0.164ug/ml（P＜0.05）,RI=7.132；高三尖酯碱、长春新碱、依托泊苷耐药指数分别为12.972、69.554、2.219，差异均有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术检测到耐药株S期细胞减少49.73％（P＜0.05），G0/G1期细胞增加50.69％（P＜0.05），G2/M期细胞减少32.80%（P＞0.05）；
　　3、RT-PCR检测显示：SHI-1/ADR细胞CAV-1基因表达增加3.042倍（P＜0.05），MDR-1基因表达增加4.529倍（P＜0.05），Beclin-1基因增加了3.839倍（P＜0.05）；
　　4、CCK-8检测示：3-MA联合阿霉素对SHI-1/ADR细胞24h抑制率（66.856±6.158）%（P＜0.05），36小时抑制率（73.583±7.707）%（P＜0.05），48h抑制率（83.209±7.639）%（P＜0.05）。流式细胞术检测示：3-MA联合阿霉素SHI-1/ADR细24h早期凋亡率（51.800±3.671）%（P＜0.05）。
　　结论：
　　通过浓度递增法成功建立了耐阿霉素细胞株SHI-1/ADR，CAV-1与Beclin-1的过表达可能参与了SHI-1/ADR细胞多药耐药的形成，窖蛋白-1与细胞自噬可能是潜在的的治疗靶点；抑制肿瘤细胞自噬是对抗白血病耐药的潜在途径，自噬剂联合常规化疗药物的应用有望成为难治复发白血病有效的治疗策略。

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中英文缩写词表

第1章前言

第2章 白血病多药耐药株SHI-1/ADR的建立及其生物学特性评价

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

讨论

参考文献

第3章 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤逆转SHI-1/ADR细胞耐药的研究及窖蛋白参与耐药性形成研究

3.1 主要材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

第4章讨论

第5章结论与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:Caveolin-1在白血病中的表达及临床生物学意义