AMPK对胃上皮间充质转化及胃癌细胞侵袭转移的抑制作用

摘要

背景和目的：
　　癌症细胞的侵袭和转移是肿瘤向恶性方向变化的重要标志。大部分癌症患者死亡并非死于原发性癌而是转移性癌。因此，本课题利用胃癌细胞模型，深入探讨癌症的侵袭和转移机制，对胃癌的治疗和预后具有重要的意义。
　　上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是胚胎发育过程中的基本现象。它不仅参与胚胎形成与发育，同时在肿瘤侵袭转移过程中起着至关重要的作用，TGF-β信号是EMT的主要诱导因子之一。AMPK（单磷酸腺苷活化激酶，AMP-activited Protein Kinase）是细胞内能量感受器，调控生物体内能量平衡。目前关于AMPK对TGF-β诱导的EMT及肿瘤侵袭迁移调节的的系统性研究尚未见报道。因此，本课题旨在研究AMPK对TGF-β诱导的上皮间充质转化（EMT）及细胞侵袭迁移的调节作用。
　　研究方法：
　　1.胃癌组织中AMPK活性与EMT相关指标的表达：以免疫组化技术对不同临床分期的胃癌标本中的AMPK活性与EMT指标的表达进行相关性分析。同时从医院组织标本库冷冻保存（-86℃）的标本中，选取16例标本，以免疫印迹技术检测AMPK活性和EMT指标，分析两者的相关性。
　　2.胃来源细胞株中AMPK活性与EMT相关指标的表达：以免疫印迹技术在胃来源细胞株中检测AMPK活性和EMT指标的表达。以划痕实验检测细胞的迁移能力。
　　3. TGF-β诱导EMT的发生：以免疫印迹技术检测在TGF-β作用SGC-7901和MKN-28细胞不同时间后EMT相关蛋白的表达，以划痕实验来观察细胞形态变化和细胞迁移能力。
　　4. AMPK抑制TGF-β诱导的EMT：以免疫印迹技术检测二甲双胍在作用细胞不同时间后AMPK磷酸化蛋白表达。以免疫印迹技术检测二甲双胍与TGF-β联合作用细胞后EMT相关蛋白表达，以进一步证明AMPK的激活是否能抑制EMT的发生。以划痕实验、Transwell实验检测细胞的侵袭迁移能力来观察AMPK对细胞生物行为学的影响。
　　结果：
　　1.胃癌组织中AMPK活性与EMT相关指标的表达：在不同临床分期的胃癌标本中 p-AMPK,E-cadherin随着分期的上升而表达下降， P-smad2,Vimentin,N-cadherind随着分期的上升而表达增加。其中p-AMPK与P-smad2,Vimentin,N-cadherin的表达负相关，与E-cadherin的表达正相关。在16例标本中 P-smad2,Vimentin,N-cadherin的表达均高于癌旁组织，而p-AMPK,E-cadherin的表达却在癌旁组织中高于胃癌组织。提示在胃黏膜癌变过程中p-AMPK对EMT起调节作用。
　　2.胃来源细胞株中AMPK活性与EMT相关指标的表达：胃癌细胞株（MKN28,SGC-7901,823）中Vimentin,N-cadherin表达均低，可以筛选为诱导EMT的细胞。
　　3. TGF-β诱导EMT的发生：随着TGF-β作用时间延长，细胞逐渐形成梭形，间充质化表型逐渐显现；SGC-7901和 MKN-28细胞中间充质特性蛋白Vimentin,N-cadherin,β-catenin表达逐渐增强，上皮特性蛋白E-cadheirn表达降低。
　　4. AMPK抑制TGF-β诱导的EMT：p-AMPK,p-ACC的表达随metformin处理时间的延长而逐渐增加；Metformin与 TGF-β联合处理细胞后，EMT间充质性蛋白表达较TGF-β组明显降低；划痕实验中TGF-β诱导后细胞迁移距离较长，而metformin+TGF-β联合处理后，细胞迁移距离明显减短。Transwell实验中TGF-β诱导之后侵袭细胞数增多，而metformin+TGF-β联合处理后，侵袭的细胞数明显降低；
　　结论：
　　1.胃癌临床标本中的 AMPK活性下降伴有 EMT指标的上升，并且与胃癌转移程度密切相关；提示 EMT指标的上升与 AMPK活性有关；
　　2. AMPK被活化后，EMT表型将显著下降，细胞实验证明了AMPK能抑制细胞的侵袭和转移。