乳腺癌MCF-7抗原负载的DC联合CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞株体内外作用的研究

摘要

背景：
　　乳腺癌是目前导致女性癌症死亡的主要原因之一。目前，针对乳腺癌的临床手段主要为手术、放疗、化疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗等多种治疗方式。虽然乳腺癌总体治疗效果很好，但有部分患者在接受规范化治疗后，仍会出现复发转移，所以对于乳腺癌的长线治疗仍然是一项具有挑战性的工作，寻找新的乳腺癌治疗策略刻不容缓。近年来，逐步有研究发现以抗原—抗体免疫反应着手，通过调节抗肿瘤的免疫反应可以利用免疫系统鉴别和消灭肿瘤的能力，从而避免肿瘤复发和转移，但其于乳腺癌治疗方面并没有被完全认识。本实验拟利用提取乳腺癌MCF-7冻融抗原，联合来源于健康人外周血的DC与CIK细胞，并共同作用于乳腺癌MCF-7细胞，观察其在对于乳腺癌细胞活性，侵袭能力及细胞种植成瘤方面的影响。
　　目的：
　　通过对健康人外周血来源的DC进行乳腺癌MCF-7冻融抗原负载，联合CIK细胞作用，观察其在对于乳腺癌细胞活性、侵袭能力及细胞种植成瘤能力的影响，从而为乳腺癌新型细胞免疫治疗提供依据。
　　方法：
　　采用循环冻融法制备人乳腺癌MCF-7无菌冻融抗原。在严格无菌条件下采取健康人50ml外周静脉血，采用梯度密度区带离心法分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC），通过细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4定向诱导，中间分组加入冻融抗原进行负载后运用TNF-α促进DC细胞成熟，并通过rhIFN-γ、rhIL-2诱导成熟的CIK细胞，两种细胞分组联合作用。以普通乳腺癌MCF-7细胞做对照，用CCK8、Transwell方法及裸鼠体内实验，联合肿瘤细胞种植皮下成瘤，分析抗原负载后对乳腺癌细胞毒作用的改变、细胞侵袭能力及成瘤能力的影响，最终评估MCF-7细胞冻融抗原负载的DC联同CIK细胞在乳腺癌治疗中的作用。
　　结果：
　　（1）乳腺癌细胞可于反复冻融状态下发生裂解并释放抗原。（2）CCK8实验结果显示：在DC细胞联合CIK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用中，DCMCF-7+CIK组在各效靶比下对于乳腺癌MCF-7细胞旳杀伤率均最高，且最佳作用效靶比为30:1，各组细胞杀伤作用有明显统计学差异（P<0.05）。（3）Transwell实验结果显示：DCMCF-7+CIK组对MCF-7细胞侵袭影响作用最大，对比其他组别，其结果差别具有统计学意义（F=61.604，P<0.05），同时进一步两两比较发现，DC+CIK组与CIK组对于MCF-7细胞侵袭水平影响的差异不大（P>0.05），无统计学意义。（4）体内实验中：各实验组裸鼠及对照组裸鼠成瘤体积存在显著性差异，DCMCF-7+CIK组裸鼠成瘤体积最小，各组间瘤体体积差别有统计学意义（F=33.549，P<0.05），DC+CIK组的成瘤体积与CIK组的成瘤体积差异不大（P>0.05），无统计学意义。
　　结论：
　　（1）外周血单个核细胞可在细胞因子的作用下成功诱导并分离DC细胞及CIK细胞。（2）经乳腺癌MCF-7抗原负载的DC细胞联同CIK细胞作用，可提高DC与CIK细胞介导的抗原抗体免疫反应，对乳腺癌MCF-7细胞具有细胞毒作用，可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞活性，并下调其侵袭能力。并在体内环境可削弱乳腺癌MCF-7细胞成瘤的能力。（3）MCF-7冻融抗原负载于DC细胞与CIK作用，或可成为乳腺癌治疗手段的一种新方向。

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中英文缩略词表

第1章 前言

1.1 研究现状

1.2 研究目的

第2章 材料与方法

2.1 细胞来源

2.2动物来源

2.3 主要试剂

2.4 主要仪器和设备

2.5 主要试剂配制

2.6 主要实验技术路线图及分组

2.7 体外实验

2.8 体内动物实验

2.9 统计分析

2.10 伦理学问题

第3章 结果

3.1 人乳腺癌MCF-7细胞镜下形态观察

3.2人乳腺癌MCF-7细胞冻融抗原浓度

3.3 健康人外周血 DC细胞的分离、定向诱导及形态观察

3.4 CIK细胞的形态观察

3.5 各组CIK细胞表型分析结果

3.6 CCK8法测定抗原负载的DC、CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞杀伤情况

3.7 Transwell法检测抗原负载的DC、CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的影响

3.8 体内实验观察抗原负载的DC与CIK细胞作用对乳腺癌MCF-7细胞成瘤能力的影响

第4章 讨论

第5章 结论

5.1 结论

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述:负载乳腺癌抗原的DC细胞联合CIK细胞在乳腺癌免疫治疗中的进展