河弧菌脂多糖单域重链抗体的生物淘选并运用于河弧菌血清分型

摘要

河流弧菌（Vibrio fluvialis,VF）是海洋中一种常见的条件致病菌，属于弧菌属，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的食源性致病菌，又名河弧菌、河川弧菌等。它是一种嗜盐的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，广泛分布于海水和稍带盐分的港湾水中。河弧菌可产生类肠毒素、细胞毒素、金属蛋白酶和溶血素等多种与致病有关的毒力因子，可引起人类河弧菌肠炎，且在全球范围内已引起大规模的腹泻散发与爆发流行，尤其在卫生条件较为落后的发展中国家，河弧菌所致的感染是一个不容忽视的公共卫生问题。鉴于河弧菌对人类引起的高危害性，因此，建立对河弧菌血清学的快速分型方法对于实现河弧菌的快速检测具有重要的意义。
　　脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)是一类由革兰氏阴性菌(Gram Negative Bacteria, GNB)产生的内毒素。脂多糖分子从内而外分别由类脂A、核心多糖和O-多糖侧链组成，其中O-多糖侧链是一种特异性O-抗原。类脂A和核心多糖结构相当保守，而O-抗原是脂多糖分子中最易发生变异的部分，在不同类群、甚至同一类群不同菌株之间，或者同一菌株不同血清分型之间都有差异。河弧菌脂多糖结构中的O-抗原结构的不同是构成其血清分型不同的主要原因。目前河弧菌血清分型的检测方法报道较少，检测技术有待提高，因此，建立一种快速灵敏地检测河弧菌血清分型的方法，对于更好地检测以及研究河弧菌具有重要的应用价值。
　　本实验首先对三种血清分型（Ma2598、EF85002、VF2）的河弧菌进行热灭活，制备菌液抗原。利用噬菌体展示技术以及液相生物淘选技术，将细菌作为靶标抗原，从天然羊驼纳米抗体库中筛选出能与河弧菌细胞壁上特异性O-抗原结合的单域重链抗体。三种血清型的河弧菌筛选后，总共挑取315个噬菌体克隆进行鉴定，最后鉴定出41个阳性克隆，并对其进行序列测定以及分析。经序列对比分析结果，最后均得到一种相同序列。本实验选取其中一个噬菌体阳性克隆2E3提取其编码基因，经构建pET-25b-2E3的表达载体，并将载体导入大肠杆菌BL21宿主菌进行目的蛋白的诱导表达，最后得到可溶性表达的蛋白。将目的蛋白经Ni-NTA柱纯化获得纯度较高的纳米抗体。将得到的纳米抗体与河弧菌进行ELISA鉴定，检测到获得的纳米抗体与河弧菌具有特异性。
　　本实验再运用热酚水法从三种河弧菌的细胞壁中提取脂多糖，用酶解法和醇沉淀法对其进行纯化，最后从河弧菌中提取获得三种结构不同的脂多糖。将提取得到的脂多糖作为靶标抗原，从羊驼天然纳米抗体文库中筛选针对脂多糖上不同O-抗原的特异性纳米抗体，通过4轮常规固相筛选，经Phage-ELISA鉴定阳性克隆，序列测定以及对比分析，最后得出8种不同序列的能特异性结合脂多糖的噬菌体克隆，可望用于3种血清型河弧菌的分型。