红米原花青素的提取纯化与抗氧化活性研究

摘要

红米是现有文献报道各种谷物中抗氧化活性最强的品种，对许多慢性疾病都有抑制治疗作用，红米中主要的抗氧化活性物质是原花青素，原花青素是清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。
　　本文以产自哈尔滨延寿县红香米为原料，在单因素实验的基础上，通过响应面实验，得出红米原花青素最佳提取条件为：丙酮浓度76％，温度39℃，料液比1:25(g/mL)，pH5，提取次数2次，时间40 min，原花青素得率为4.37±0.02mg/g，是现有文献报道中红米原花青素含量最高的传统斯里兰Sudu Heenati红米的1.925倍。采用D101大孔树脂对提取后的红米原花青素进行纯化，最佳纯化条件为：上样流速1 ml/min，上样浓度0.68 mg/ml，上样量5 BV，水洗体积5 BV，丙酮解析液浓度60%，解析液用量4 BV，原花青素纯度为85.37±1.5%。
　　将纯化后的红米原花青素用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离，得到六个组分。采用间苯三酚-HPLC法测原花青素的平均聚合度(mDP)，结果红米原花青素纯化物的mDP为4.14，分离的六个组分的mDP及在红米原花青素纯化物中的占比(w/w)分别为2.83(21.32%)，3.46(24.64%)，3.84(19.37%)，6.18(11.90%)，8.56(11.61%)，12.65(4.03%)。说明红米原花青素按聚合度分离效果明显，且在人体小肠部位吸收利用的低聚体组分(DP＜4)的占比大于70%，高于高聚体，说明低聚体是红米原花青素中主要的组成成分。
　　清除自由基的活性是原花青素所有生理药理活性的基础，受原花青素的结构，特别是聚合度的影响很大，因此研究原花青素平均聚合度和抗氧化活性的关系具有十分重要的意义。以抗坏血酸(Vc)为对照组，对比这六个组分的DPPH·和ABTS+自由基清除效果以及还原能力，结果如下：各组分对DPPH·自由基清除效果依次为抗坏血酸＜mDP=2.83＜mDP=3.46＜mDP=12.65＜mDP=3.84＜mDP=6.18＜mDP=8.56；对 ABTS+自由基清除效果依次为抗坏血酸＜mDP=2.83＜mDP=3.46＜mDP=12.65＜mDP=3.84＜mDP=6.18＜mDP=8.56；还原能力依次为抗坏血酸＜mDP=12.65＜mDP=2.83＜mDP=3.46＜mDP=3.84＜mDP=6.18＜mDP=8.56；各组分对DPPH·和ABTS+自由基清除效果以及还原能力均大于抗坏血酸，且与剂量存在量效关系；红米原花青素的 DPPH·和ABTS+自由基清除效果以及还原能力与 mDP有一定的关系，其中前五个组分(mDP=2.83~8.56)的抗氧化活性随mDP增加而增加，最后一个组分(mDP=12.65)的抗氧化活性显著降低，其中还原能力降低最显著，低于第一个组分(mDP=2.83)。
　　研究了红米原花青素中主要组成成分低聚体的结构组成，采用红外图谱分析发现红米原花青素主要是(+)-(表)儿茶素的结构单元构成的原花青定聚合物。采用超高效液相色谱-电喷雾质谱联用(UPLC-ESI-MS)法，检测到(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素两种单体，四种A型二聚体和三种B型二聚体，一种A型三聚体和一种 C型三聚体，未检测出没食子酸单酯及其聚合体，说明红米原花青素与葡萄原花青素不同，为非酯性原花青素，红米原花青素的单体中(-)-表儿茶素的含量最高，(+)-儿茶素其次。
　　由于原花青素的氧化降解，红米在存储过程中会发生颜色的变化和生理活性的降低。原花青素酚羟基的结构不稳定，容易受环境影响而被破坏，因此对红米的开发利用必须考虑原花青素的稳定性。本文研究了光照、pH、温度、金属离子、氧化剂、还原剂、食品添加剂等七种因素对红米原花青素储存稳定性的影响。结果表明光照显著降低红米原花青素的稳定性，应在避光条件下存储红米原花青素；酸性条件下红米原花青素具有较好的稳定性，其中pH为4时稳定性最好，而碱性条件对原花青素破坏很大，pH为8时储存10h后保存率降低到50.55%；温度超过40℃时红米原花青素的稳定性显著降低，而低温下红米原花青素稳定性较好，最适储存温度为4℃；金属离子中Na+、K+、Mg2+、Ca2+离子对原花青素稳定性影响较小，而Fe2+、Cu2+离子对原花青素稳定性破坏较大；红米原花青素对氧化剂的稳定性很差，很容易被氧化造成原花青素的损失，添加1%双氧水的红米原花青素储存24h后保存率降低到55.82%；还原剂能提高红米原花青素的稳定性，其中添加0.4%的亚硫酸氢钠储存24h后红米原花青素的保存率最高，为98.9%；食品添加剂食盐和葡萄糖均可提高红米原花青素的稳定性，其中食盐最适添加浓度为0.4%，葡萄糖最适添加浓度为0.6%。

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第一章 前言

1.1 原花青素

1.2红米概述

1.3红米的研究现状

1.4研究意义和内容

第二章 响应面优化红米原花青素提取工艺

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果与讨论

2.4本章小结

第三章 大孔吸附树脂分离纯化红米原花青素

3.1 实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果与讨论

3.4本章小结

第四章 红米原花青素的聚合度及抗氧化活性

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果与讨论

4.4本章小结

第五章红米原花青素稳定性研究

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3 结果与讨论

5.4本章小结

第六章 结论与展望

6.1结论

6.2展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果