熊果酸体内干预对肝星状细胞、干细胞及枯否细胞NOX表达的影响

摘要

背景：
　　近年研究表明，表达于肝星状细胞（HSCs）、肝细胞（HCs）及枯否细胞（KCs）表面的NADPH氧化酶（NOX）在肝纤维化的发生发展中起重要作用。本课题组前期体内研究发现熊果酸（UA）具有抗肝纤维化作用；体外研究发现UA能阻断HSCs表面的NOX诱导其凋亡；抑制HCs表面的NOX保护HCs。但UA体内对HSCs、HCs及KCs中NOX表达的影响尚不明确。本课题以纤维化大鼠作为研究对象，以加拿大麻素（AP）作为阳性对照，正常大鼠作为空白对照，观察UA干预（预防和治疗）对肝纤维化的逆转作用；明确UA体内抗肝纤维化的机制是否与抑制HSCs、HCs及KCs中NOX的表达相关。
　　目的：
　　观察UA干预后肝纤维化大鼠体内肝星状细胞、肝细胞及枯否细胞表面NOX的表达,探讨UA体内抗纤维化的机制及分子靶点。
　　方法：
　　1．将雄性SD大鼠随机分为6组：空白对照组、肝纤维化模型组、AP预防及治疗组、UA预防及治疗组，其中，肝纤维化组给予四氯化碳（CCl4）灌胃2ml/kg（橄榄油稀释20％浓度）每周两次，共8周；预防组在CCl4灌胃2周后，给予AP或UA（40mg/kg/d）灌胃6周，同时继续CCl4灌胃6周；治疗组在CCl4灌胃8周后，再给予AP或UA（40mg/kg/d）灌胃4周。药物处理结束72h后，获取血、肝脏标本。
　　2．HE染色观察肝小叶结构；天狼星红染色法观察胶原沉积程度；比色法测定血清及肝脏组织羟脯氨酸含量；WB检测肝组织的I型胶原、TGFβ1、MMP-1、TIMP-1和α-SMA的蛋白含量。
　　3．全自动生化仪检测大鼠血清中ALT、ALB、TBIL；IHC检测大鼠肝组织PCNA表达；TUNEL检测肝细胞凋亡。
　　4．WB检测肝组织中NOX1、NOX2及NOX4蛋白表达。
　　5．原位灌注+梯度离心分离原代HSCs、HCs及KCs，RT-qPCR检测三种细胞NOX的mRNA水平。
　　结果：
　　1.熊果酸体内干预对肝纤维化的影响
　　与纤维化组相比，UA预防和治疗组肝脏组织纤维间隔及胶原沉积均减轻，大鼠血清及肝脏组织羟脯氨酸含量显著降低（P＜0.001）；UA预防组肝脏组织中I型胶原、TGFβ1、TIMP-1及α-SMA蛋白表达水平均降低（分别为P＜0.01， P＜0.001，P＜0.01及P＜0.001）；UA治疗组上述指标也降低（分别为P＜0.001， P＜0.001，P＜0.01及P＜0.001）；UA预防和治疗组肝脏组织MMP-1蛋白表达水平升高（P＜0.01）。
　　2.熊果酸体内干预对肝功能及肝细胞的影响
　　与纤维化组相比，UA预防和治疗组大鼠血清ALT、TBIL水平下降，而ALB水平上升（均为P＜0.001）；肝细胞增殖增加（P＜0.01），凋亡减少（P＜0.01）。
　　3.熊果酸体内干预对肝脏组织中NOX蛋白的影响
　　与纤维化组相比，UA预防组肝脏组织中NOX1、NOX2及NOX4蛋白表达均减少（分别为P＜0.01，P＜0.01和P＜0.001）；UA治疗组上述指标蛋白表达也减少（分别为P＜0.001，P＜0.01和P＜0.001）。
　　4.熊果酸体内干预对HSCs、HCs及KCs中NOX mRNA的影响
　　4.1熊果酸体内干预对HSCs中NOX mRNA的影响
　　与纤维化组相比，UA预防组HSCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下调（分别为P＜0.01，P＜0.01和P＜0.001）；UA治疗组上述指标的mRNA水平也下调（分别为P＜0.001，P＜0.01和P＜0.001）。
　　4.2熊果酸体内干预对HCs中NOX mRNA的影响
　　与纤维化组相比，UA预防组HCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下降（分别为P＜0.001，P＜0.01和P＜0.001）；UA治疗组HCs中NOX2及NOX4的mRNA水平也下降（分别为P＜0.01和P＜0.001），而UA治疗组HCs中NOX1的mRNA水平无统计学意义（P＞0.05）。
　　4.3熊果酸体内干预对KCs中NOX mRNA的影响
　　与纤维化组相比，UA预防组KCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下降（均为P＜0.001）；UA治疗组KCs中上述指标的mRNA水平也下降（分别为P＜0.01，P＜0.05和P＜0.001）。
　　结论：
　　熊果酸体内抗肝纤维化机制与其下调肝星状细胞、肝细胞及枯否细胞NOX的表达有关。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 研究方法

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 熊果酸体内干预对肝纤维化的影响

3.2 熊果酸体内干预对肝功能及肝细胞的影响

3.3 熊果酸体内干预对肝脏组织中NOX蛋白的影响

3.4 熊果酸体内干预对HSCs、HCs及KCs中NOX mRNA的影响

第4章 讨论

4.1 NADPH氧化酶在肝纤维化发病中的作用

4.2 NOX在HSCs中的表达及其在肝纤维化中的作用

4.3 NOX在HCs中的表达及其在肝纤维化中的作用

4.4 NOX在KCs中的表达及其在肝纤维化中的作用

4.5 中药单体熊果酸的抗肝纤维化作用

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:肝巨噬细胞在肝纤维化发生、发展中的双向调节作用