芳基硫酸酯酶B的表达与分布与SOD1 G93A转基因小鼠神经元死亡的相关性研究

摘要

背景与目的：
　　肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种以进行性和选择性损伤的上下运动神经元为主的慢性的致命性运动神经元疾病，病变主要累及大脑皮层运动神经元、脊髓前角细胞及脑干运动神经核。ALS起病隐匿、预后很差，患者常在3-5年内死于呼吸肌麻痹，目前尚无特异的诊断和治疗方法。若能找到敏感的疾病相关蛋白，不仅能早期诊断ALS、跟踪疾病进展、评估治疗后的反应，还能帮助我们更好地理解ALS的分子发病机制。但目前已发现的致病蛋白只能部分解释肌萎缩侧索硬化症的可能发病机制。因此，这项研究主要为了寻找与肌萎缩侧索硬化症发病相关的新蛋白。
　　前期我们通过对SOD1-G93A转基因小鼠的脑和脊髓进行蛋白组学分析找出差异蛋白，然后通过观察野生型和SOD1 G93A转基因小鼠脊髓在不同发病阶段脊髓节段、区域以及神经细胞中ARSB的表达和分布情况以便达到初步揭示ARSB在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中分布规律，证实ARSB是ALS可能的疾病相关蛋白。
　　方法：
　　通过构建B6SJL-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠动物模型，通过与正常的C57BL/6J交配繁殖，用PCR技术检测和筛选出SOD1-G93A阳性子代小鼠，进行ALS差异蛋白ARSB的验证：
　　（1）Western blot的研究对象
　　12只小鼠，包括：携带SOD1-G93A基因的可发病1代9只小鼠，为实验组，根据小鼠的神经功能评分及年龄分为3个亚组：①未发病组（60-70天）；②发病组（90-100天）；③进展组（120-130天）。每组均为3只，正常野生型B6小鼠3只为为正常对照组，其鼠龄均为60-70天。
　　（2）Western blot实验
　　剥取12只小鼠的脊髓，提取小鼠的脊髓蛋白并进行浓度检测。每次Western blot将比较实验组和对照组共4只小鼠脊髓中的ARSB蛋白表达水平，重复3次。运用Quantity One软件作相对光密度分析。
　　（3）免疫荧光实验的研究对象
　　18只小鼠，包括：携带SOD1-G93A基因的可发病1代小鼠9只为实验组，根据小鼠神经功能评分及年龄分为3个亚组：未发病组、发病组、进展组，每组3只；正常野生型B6小鼠9只为正常对照组，3个亚组按年龄分为：60-70天，90-100天，120-130天，每组3只。
　　（4）免疫荧光实验
　　剥取18只小鼠脊髓，制作冰冻切片，每组每一只小鼠的脊髓切片分别分为颈段、胸段及腰段。
　　免疫荧光单标实验：每个节段共观察9张脊髓切片。针对每张切片，在荧光显微镜4×、10×、20×、40×放大倍数下观察脊髓白质和灰质内ARSB阳性细胞分布的概况；对有ARSB阳性细胞分布的脊髓灰质，按照不同解剖区域，在20×放大倍数下对2个灰质前角、2个灰质后角及中央管周围各取1个视野（即对一张脊髓切片共取5个视野），运用Image-Pro Plus6.0软件，分析ARSB阳性细胞数、计算阳性细胞率。
　　（5）统计分析和图像处理
　　通过SPSS17.0统计软件包处理数据，所有数据均采用“均数±标准差”来表示，采用析因设计方差分析法来进行统计分析，两两相比较采用Bonferroni法， P＜0.05被认为具有统计学意义。
　　ALS差异蛋白ARSB的验证结果：
　　（1）Western blot的验证结果
　　在ARSB的表达中对照组<实验组，且实验组的表达随病情的进展而上调。
　　（2）免疫荧光实验的验证结果
　　ARSB阳性细胞广泛存在于实验组和对照组小鼠的脊髓灰质内，在脊髓白质内ARSB阳性细胞的未见表达。
　　实验组小鼠脊髓ARSB阳性细胞的分布特征：在实验组小鼠的颈段，在中央管周围、灰质前角和灰质后角区域，不同疾病阶段的小鼠，其ARSB阳性细胞百分率有显著差异，且随病情的进展而增高。
　　对照组小鼠脊髓中ARSB阳性细胞的分布特征：在对照组小鼠的颈段和胸段，60-70天年龄段的小鼠在中央管、灰质前角、灰质后角3个不同解剖区域内的ARSB阳性细胞百分率有显著差异，且灰质前角>灰质后角>中央管。在对照组小鼠的腰段，不同年龄段的小鼠，其灰质后角区域ARSB阳性细胞百分率有显著差异，且呈随年龄增加而增高的趋势。
　　疾病作为独立因素存在时，对小鼠脊髓ARSB的阳性细胞百分率有影响，且极其显著（P=0.00），无论在实验组小鼠脊髓的颈段、胸段还是腰段，在同一解剖区域内其脊髓ARSB阳性细胞百分率平均值均高于正常对照组。解剖区域作为独立因素存在时，对小鼠脊髓ARSB的阳性细胞百分率有影响（P=0.01）， ARSB阳性细胞的分布在不同解剖区域内的变化规律为：灰质前角>中央管>灰质后角。
　　结论：
　　本研究是首个基于SOD1-G93A转基因小鼠模型、运用Western blot、免疫荧光技术进行ALS疾病相关致病蛋白的系统性研究，得出结论如下：
　　首次阐明ARSB蛋白在SOD1-G93A转基因小鼠及正常对照小鼠脊髓不同不同节段、解剖区域及不同年龄时的表达和分布规律：ARSB蛋白在SOD1-G93A转基因小鼠中的表达高于正常对照小鼠，并随病情的进展表达上调；ARSB阳性细胞广泛分布于各组小鼠的脊髓灰质内，当疾病、解剖区域、节段、年龄作为独立因素存在时，将影响小鼠脊髓ARSB的阳性细胞百分率。
　　因此，ARSB可能是ALS的疾病相关蛋白。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 肌萎缩侧索硬化概述

1.2 SOD1-G93A转基因小鼠及其疾病相关蛋白

1.3Arylsulfatase B与ALS的潜在相关性

1.4 本课题的研究内容

第2章 肌萎缩侧索硬化差异蛋白Arylsulfatase B的验证

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结 果

2.4 讨论

2.5 结 论

全文总结

一、主要成果

二、存在的不足

三、远景展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:C9orf72与肌萎缩侧索硬化发病的研究