TLR4拮抗剂TAK-242对小鼠实验性结肠炎的作用及其机制研究

摘要

背景和目的： 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）为一类反复发作非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。其发病机制目前尚不明确，已知多因素共同参与致病，包括环境因素、遗传易感性、肠道菌群、免疫异常等。而肠道黏膜免疫异常在 IBD发病中至关重要。近年来随着对TLR4信号转导通路在IBD发病机制中的作用的不断深入研究，针对阻断此通路以避免过强的炎症反应的免疫治疗己经成为 IBD治疗的新方向。虽已有较多阻断此通路的研究报道，但是关于TLR4拮抗剂TAK-242对IBD的影响却未见报道，故本研究探讨了TLR4拮抗剂TAK-242对小鼠实验性结肠炎的干预作用及其可能机制。 方法： （1）实验分组：80只BABL/c鼠随机分为以下5组： 1、Control组（n=16） 2、DSS组（n=16） 3、DSS+TAK-242组（n=16） 4、TNBS组（n=16） 5、TNBS+TAK-242组（n=16） （2）实验性结肠炎模型的建立： 1、DSS诱导结肠炎模型：BABL/c小鼠，自由饮用5%DSS溶液7天。 2、TNBS诱导结肠炎模型：BABL/c小鼠，于禁食、不禁饮24小时后，乙醚麻醉，利用3.5F导管插入肛门约5.5cm，灌注TNBS/50%乙醇溶液100μl，将小鼠倒置1分钟。 （3）TAK-242干预方法： 自造模第5天开始， DSS+TAK-242组、TNBS+TAK-242组小鼠给予TAK-242溶液（3mg/kg），腹腔注射，1次/日，连续3天。 （4）观察指标： ①各组小鼠疾病活动指数DAI的变化 ② H&E染色观察小鼠结肠黏膜病理学变化 ③多重磁珠酶免分析法检测小鼠血清中IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平 ④免疫组化法检测结肠组织 TLR4、MyD88、NF-κB p65、Foxp3、HMGB1蛋白的表达 ⑤ Western-bolt检测结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65、 HMGB1蛋白的表达 结果： （一）TAK-242干预对小鼠实验性结肠炎症状及病理改变的影响： ① DAI评分：造模结束后，模型组小鼠均出现体重减轻、腹泻、血便等症状表现。造模第7天，无论有无TAK-242干预，DSS和TNBS模型组小鼠DAI均明显高于Control组（P<0.01）；DSS+TAK-242组与DSS组相比DAI明显下降（P<0.01）。TNBS+TAK-242组与TNBS组相比DAI有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。 ②组织病理学评分：小鼠结肠炎症程度、病变深度、隐窝破坏评分在DSS组和 TNBS模型组以及它们相对应的 TAK-242干预组均显著高于Control组（P<0.01）；在 TAK-242干预组均显著低于相对应的模型组（P<0.01）。 （二）TAK-242干预对小鼠血清中细胞因子的影响： ①血清IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平在DSS模型组和DSS+TAK-242干预组均显著高于Control组（P<0.001，P<0.01），其中TAK-242干预组血清IL-1β、TNF-α水平均显著低于模型组（P<0.01）；IL-6水平在DSS模型组显著高于Control组和TAK-242干预组（P<0.001），而Control组和TAK-242干预组之间无差异（P>0.05）。 ②血清IL-6、IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平在TNBS模型组均显著高于Control组（P<0.01）。在TNBS+TAK-242组IL-6和IFN-γ水平显著低于TNBS模型组（P<0.001），IL-1β、TNF-α水平虽低于 TNBS模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）；IL-6水平与Control组之间差异无统计学意义（P>0.05），而IFN-γ、IL-1β、TNF-α水平仍显著高于Control组（P<0.001， P<0.001，P<0.01）。 （三）小鼠结肠粘膜TLR4、MyD88、NF-κBp65、HMGB1、Foxp3的表达： 1、小鼠结肠粘膜TLR4的表达： ①免疫组化染色发现：DSS和TNBS模型组显著高于Control组（P<0.001）。TAK-242干预组显著低于相应的模型组（P<0.001），但仍高于 Control组（P<0.01）。 ②免疫印迹检测发现：DSS模型组 TLR4的表达均显著高于 Control组（P<0.01）；TAK-242干预组显著低于模型组（P<0.01），与Control组比较无统计学差异（P>0.05）。TNBS模型组和TNBS+TAK-242干预组TLR4的表达均显著高于Control组（P<0.01）；TAK-242干预后，与TNBS组比较，TLR4表达有下调趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。 2、小鼠结肠粘膜MyD88的表达： ①免疫组化染色发现： DSS和 TNBS模型组显著高于 Control组（P<0.001）。TAK-242干预组显著低于相应的模型组（P<0.001），但仍高于Control组（P<0.01）。 ②免疫印迹检测发现：DSS模型组 MyD88的表达均显著高于 Control组（P<0.01）；TAK242干预组显著低于模型组（P<0.01），与Control组比较无统计学差异（P>0.05）。TNBS模型组和 TNBS+TAK-242干预组MyD88的表达均显著高于Control组（P<0.01）；TAK-242干预后，与TNBS组比较，MyD88表达明显下调（P<0.01）。 3、小鼠结肠粘膜NF-κBp65的表达： ①免疫组化染色发现： DSS和 TNBS模型组显著高于 Control组（P<0.001）。TAK242干预组显著低于相应的模型组（P<0.001），但仍高于Control组（P<0.01）。 ②免疫印迹检测发现：DSS模型组NF-κBp65的表达均显著高于Control组（P<0.01）；TAK-242干预组显著低于模型组（P<0.01），与 control组比较无统计学差异（P>0.05）。TNBS模型组和TNBS+TAK-242干预组NF-κBp65的表达均显著高于Control组（P<0.01）；TAK-242干预后，与TNBS组比较，NF-κBp65表达明显下调（P<0.01）。 4、小鼠结肠粘膜HMGB1的表达： ①免疫组化染色发现： DSS和 TNBS模型组显著高于 Control组（P<0.001）。TAK-242干预组显著低于相应的模型组（P<0.001），但仍高于Control组（P<0.01）。 ②免疫印迹检测发现：DSS模型组HMGB1的表达均显著高于Control组（P<0.01）；TAK-242干预组显著低于模型组（P<0.01），与Control组比较无统计学差异（P>0.05）。TNBS模型组和TNBS+TAK-242干预组HMGB1的表达均显著高于Control组（P<0.01）；TAK-242干预后，与TNBS组比较，HMGB1表达明显下调（P<0.01）。 5、小鼠结肠黏膜 Foxp3表达： 免疫组化染色发现：DSS和TNBS模型组显著低于Control组（P<0.001）。TAK-242干预组显著高于相应的模型组（ P<0.001），但仍低于 Control组（P<0.001）。 结论： 1、TLR4拮抗剂TAK-242对小鼠实验性结肠炎具有治疗作用。 2、TLR4拮抗剂TAK-242对小鼠实验性结肠炎的抗炎作用机制可能是抑制TLR4/NF-κB信号通路及阻断了HMGB1/TLR4反馈回路。