缺氧诱导因子-1α在系统性硬化相关肺动脉高压兔模型中的作用研究

摘要

目的： 1.探讨博来霉素（bleomycin, BLM）联合野百合碱（monocrotaline, MCT）建立系统性硬化肺动脉高压（ Systemic sclerosis associated pulmonary arterial hypertension, SSc-PAH）兔模型的可能性；2.探讨缺氧诱导因子1-α（hypoxia-inducible factor1α, HIF-1α）在SSc-PAH模型中的表达及作用机制。 方法： 第一部分实验：40只健康雄性幼兔随机分成4组：溶剂对照组（n=10）、BLM单药造模组（n=10）、小剂量MCT造模组（n=10）、小剂量MCT+BLM联合造模组（n=10）。BLM单药造模组造模方法：每日给予100ul/只的1mg/ml的BLM溶液腹腔注射，持续3周；小剂量MCT造模方法：在第1日给予一次性腹腔注射40mg/kg MCT溶液；MCT+BLM联合造模组造模方法：联合以上2种造模方法；溶剂对照组：按上述配比溶液的体积给予溶剂腹腔注射。造模3周后，测量肺动脉平均压力值(mean pulmonary artery pressure, mPAP)、解剖取材，称量计算右室肥厚指数（right ventricular hypertrophy index, RVHI），将皮肤、肺动脉干以及右肺上叶进行石蜡包埋、切片以及苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色，观察4组之间各组织的病理差异。 第二部分实验：30只健康雄性幼兔随机分成3组：溶剂对照组（n=10）、模型组（n=10）以及HIF-1α抑制组（n=10）。模型组按MCT+BLM联合造模的方法造模， HIF-1α在造模的同时每日给予HIF-1α抑制剂——2-甲氧基雌二醇（2-ME2）腹腔注射，溶剂对照组每日腹腔注射相同体积的上述溶剂。药物干预3周后，测量肺动脉压力值、解剖取材，称量计算 RVHI，将皮肤、肺动脉干以及右肺上叶进行石蜡包埋、切片以及HE染色，观察病理变化。采用Western blotting和免疫组化对各组的肺组织中 HIF-1α以及巨噬细胞游走抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）的蛋白进行定量和定位检测。 结果： 第一部分实验：造模3周后，有7只实验对象死亡，分别有1、2、2、2只出现在溶剂对照组、BLM单药造模组、小剂量 MCT造模组以及小剂量MCT+BLM联合造模组。存活的33只实验对象中，单药造模组和联合造模组的实验对象局出现局部皮肤毛发的脱落以及皮肤的变硬。联合造模组的肺动脉压力值均达到30mmHg以上，且其肺动脉压力与RVHI均明显高于其他三组，具有统计学意义（P＜0.05），BLM造模组的肺动脉压力及RVHI均稍高于溶剂对照组，但两者均无统计学意义（P＞0.05），MCT造模组部分实验动物（62.5%）肺动脉压力高于30mmHg，肺动脉压力及RVHI较BLM造模组及溶剂对照组升高，具有统计学意义（P＜0.05）。BLM造模组及联合造模组的皮肤病理均出现毛囊的过度角化，血管壁的增厚，皮肤附属器减少甚至消失，真皮层的增厚，并伴有大量的胶原蛋白及成纤维细胞在真皮层内的增生；联合造模组的肺动脉干出现管壁的明显增厚、管腔的狭窄甚至闭塞以及内膜的乳头状改变，在右肺上叶的病理中，联合造模组的肺小血管管壁明显增厚，管腔狭窄甚至阻塞，肺微血管和小血管存在明显的血管重构，在血管周及肺泡间隔有大量的炎性细胞浸润，肺泡腔内有大量的红细胞；部分MCT造模组的肺动脉干出现管壁的增厚，肺组织中的肺小动脉壁增厚，管腔狭窄，部分出现血管重构；而溶剂对照组及单药造模组的肺动脉干和右肺上叶组织病理基本保持了正常的结构。 第二部分实验：药物干预3周后，三组间的肺动脉压力及RVHI均有差异，模型组明显高于另两组，且均具有统计学意义（P＜0.05），HIF-1α抑制组较溶剂对照组高，均具有统计学意义（P＜0.05）。病理结果示：模型组毛囊角化、真皮层增厚、胶原增生、皮肤附属器减少，HIF-1α抑制组仅出现真皮层稍增厚，无其他异常改变；模型组的肺动脉干及肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄，肺微动脉和小动脉有明显的血管重构发生，炎性细胞在肺间质中浸润，HIF-1α抑制组出现肺动脉干及肺小动脉的管壁稍增厚，无明显管腔狭窄，无血管重构的发生，溶剂对照组的皮肤、肺动脉干以及右肺上叶组织均呈现正常结构。Western blotting显示：与溶剂对照组相较，模型组的HIF-1α蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.001），当HIF-1α蛋白被抑制时，MIF蛋白表达明显下调，与模型组相比较差异具有统计学意义（P＜0.001）。免疫组化结果示：溶剂对照组模型的肺组织肺动脉壁上HIF-1α弱阳性表达，而SSc-PAH模型中HIF-1α在肺动脉壁的内皮细胞上呈明显的强阳性表达；相较与模型组中MIF在肺动脉壁内皮细胞的强阳性表达，当HIF-1α被抑制后，MIF蛋白的表达明显减弱。 结论： 1.小剂量MCT联合BLM建立的模型肺动脉压力均达到30mmHg以上，组织学上符合SSc-PAH的病理特征，或可成为SSc-PAH模型的选择之一；2.HIF-1α蛋白在SSc-PAH模型中表达升高，主要表达在肺动脉壁的内皮细胞上，而在给予2-ME2抑制HIF-1α蛋白表达后，肺动脉压力下降，病理出现改善，提示HIF-1α在SSc-PAH发病机制发挥着重要作用。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 SSc-PAH概述

1.2 SSc-PAH模型研究进展

1.3 HIF-1α介导SSc-PAH的机制

1.4 研究意义

第2章 系统性硬化症相关肺动脉高压动物模型的建立

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 统计分析

2.2实验结果

2.2.1一般情况

2.2.2血液动力学结果

2.2.3病理结果

2.3讨论

第3章 HIF-1α在SSc-PAH兔模型中的表达及作用

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 统计分析

3.2实验结果

3.2.1 一般情况

3.2.2 血液动力学结果

3.2.3 病理结果

3.2.4 HIF-1α蛋白在SSc-PAH兔模型中的表达情况

3.2.5 MIF蛋白在HIF-1α抑制组中的表达情况

3.3讨论

3.3.1系统性硬化肺动脉高压的发病机制

3.3.2 HIF-1α与系统性硬化肺动脉高压

3.3.3 MIF与系统性硬化肺动脉高压

3.3.4 HIF-1α与MIF

第4章 结论与展望

4.1结论

4.2不足与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 系统性硬化肺动脉高压的药物治疗进展