Efp介导14-3-3η泛素化降解影响心肌细胞IPC保护作用

摘要

目的： 心肌缺血预适应（Ischemic preconditioning,IPC）指的是长时间缺血前，先对心肌进行一至多次短暂性缺血，每次缺血后紧接着进行短暂性再灌注。IPC可提高心肌抵抗长时间缺血损伤的能力。本实验旨在探讨心肌细胞IPC作用中，雌激素效应环指蛋白（Estrogen responsive finger protein,Efp）是否与14-3-3η存在相互作用；上调或下调Efp表达水平对14-3-3η表达水平及其泛素化状态的影响，以及对IPC保护作用的影响。期许对IPC保护作用机制有进一步了解。 方法： 本实验采用H9c2心肌样细胞，构建缺氧预适应（Anoxic preconditioning,APC）模型、缺氧复氧（Anoxic/Reoxygenation,A/R）损伤模型。采用AD-Efp、AD-EfpRNAi重组腺病毒载体感染H9c2细胞，上调、下调Efp表达水平；Efp、14-3-3η和ubiquitin（ub）蛋白表达水平采用免疫印迹(Western blotting)法检测；免疫共沉淀（Co-ip）法检测Efp与14-3-3η是否存在相互作用，及上调或下调Efp表达水平对14-3-3η泛素化程度的影响；MTS法检测细胞存活率；分光光度法检测乳酸脱氢酶（LDH）活性；流式细胞仪检测细胞内活性氧水平(ROS)、线粒体膜电位稳定性(Δψm)及细胞凋亡水平，用于评价上调或下调Efp表达水平对心肌细胞APC保护作用的影响。 结果： 1.Control组、A/R模型预处理组、APC模型预处理组H9c2心肌样细胞蛋白裂解液与Efp或14-3-3η一抗孵育后可以检测到14-3-3η或Efp蛋白印迹。 2.与 APC组比较，APC+AD-Efp组14-3-3η蛋白表达水平明显下降(p<0.01)，APC+AD-EfpRNAi组14-3-3η蛋白表达水平明显上升(p<0.01)；与APC+AD-Efp组，加入蛋白酶体抑制剂MG-132显著上调14-3-3η蛋白表达水平(p<0.01)。 3.与APC+MG-132组比较，APC+AD-Efp+MG-132组14-3-3η蛋白泛素化程度显著加强。 4.与APC组比较，APC+AD-Efp组细胞存活率显著下降，LDH活性显著上调，ROS生成量增多，线粒体膜电位（Δψm）稳定性显著下降，细胞凋亡水平明显上升(p<0.01)；APC+AD-EfpRNAi组细胞存活率显著上升，LDH活性显著下调， ROS生成量减少，Δψm稳定性显著上升，细胞凋亡水平明显下降(p<0.01)。 结论： 在H9c2心肌样细胞中，Efp与14-3-3η存在相互作用。在H9c2心肌样细胞APC保护作用中，Efp介导14-3-3η发生泛素化及降解；上调Efp表达水平APC保护作用减弱，下调Efp表达水平APC保护作用增强，此作用结果可能与Efp对14-3-3η蛋白表达水平的影响有关。

目录

声明

英文缩写、全称和中文对照

第1章 引 言

第2章 材料与方法

2.1 主要材料与试剂

2.2 实验主要仪器和设备

2.3 实验方法

2.4 数据处理

第3章 结果

3.1 在H9c2细胞中，14-3-3η与Efp之间存在相互作用

3.2 高表达Efp、低表达Efp重组腺病毒载体感染H9c2细胞的最适条件的摸索结果

3.3 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对14-3-3η表达水平的影响

3.4 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对14-3-3η蛋白泛素化的影响

3.5 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对H9c2细胞中的乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响

3.6 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对H9c2细胞存活率的影响

3.7 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对H9c2细胞活性氧（ROS）水平的影响

3.8 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对H9c2细胞线粒体膜电位的影响

3.9 APC作用中，上调或下调Efp表达水平对H9c2细胞凋亡的影响

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

综述: 有关雌激素效应环指蛋白的研究进展