两亲性肽自组装凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞方向分化的研究

摘要

研究目的： 探讨骨髓间充质干细胞在含IKVAV两亲性肽凝胶生长情况及凝胶诱导骨髓间充质干细胞分化情况。 研究方法： 1、骨髓间充质干细胞经全骨髓贴壁分离、培养，倒置显微镜下观察细胞形态学、流式细胞术检测细胞表面 CD29抗原、CD34抗原、CD45抗原、CD90抗原；细胞经培养基诱导分化后在显微镜下观察细胞向成脂、成软骨方向分化情况。 2、设计实验组IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)及实验对照组EQS(谷氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸)两亲性肽；将10mg/mL含IKVAV两亲性肽溶液加入等体积 DMEM/F12数秒后自组装成三维凝胶，进行透射电镜显微镜( TEM)观察三维凝胶内部结构。IKVAV两亲性肽凝胶与骨髓间充质干细胞的复合性培养，经活死细胞检测试剂 Calcein-AM/PI双标染色，在荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在IKVAV两亲性肽凝胶内存活情况。1×106 cells/mL骨髓间充质干细胞悬液与零界点凝胶进行混合形成凝胶（三维培养体系）及1×106 cells/mL骨髓间充质干细胞悬液接种于两亲性肽凝胶包被的盖波片表面(二维培养体系)，在完全培养基下培养，经CCK-8法检测IKVAV两亲性肽凝胶对骨髓间充质干细增殖/毒性作用。 3、含细胞的培养液与多肽溶液混合后发生自组装形成三维培养体系，实验分成3组：A组：单纯骨髓间充质干细胞培养（空白对照组）；B组：EQS凝胶与细胞共同培养形成的三维培养体系（实验对照组）；C组：IKVAV凝胶与细胞共同培养形成的三维培养体系（实验组）。运用蛋白质印迹法检测各组骨髓间充质干细胞中MAP-2蛋白、GFAP蛋白、NSE蛋白表达水平；运用细胞免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞中GFAP蛋白，NSE蛋白表达水平。 结果： 1、倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞呈长梭形，呈漩涡状态排列；原三代骨髓间充质干细胞进行流式细胞术检测，结果显示骨髓间充质细胞高表达CD29抗原和CD90抗原，不表达或者低表达CD34抗原和CD45抗原；骨髓间充质干细胞经成脂诱导培养基诱导培养25天后出现脂滴，经油红O染色后变成红色；经成软骨诱导培养基诱导培养24天后，进行阿利辛蓝染色后可见细胞内的内酸性粘多糖染成浅绿色。 2、实验组IKVAV（谷氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸）肽设计序列：C16H31OA3G4D2-IKVAV；对照组EQS（谷氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸）肽设计序列：C16H31OA3G4D2-EQS。电子显微镜显示IKVAV两亲性肽凝胶由多维纳米纤维构成，纳米纤维直径3～6 nm，长度50～500 nm；质谱测得合成IKVAV两亲性肽分子量为1438.71，与其理论值一致；HPLC分析IKVAV两亲性肽纯度为95.74%；Calcein-AM/PI双标染色显示：骨髓间充质干细胞与凝胶复合培养1天，3天，5天后，用Calcein-AM/PI（活死细胞染色）对培养1天，3天，5天分别进行染色，在荧光显微镜下对活死细胞进行计数，结果可发现随着时间的增加，活细胞的数目明显增加，然后其死亡细胞未见明显变化。CCK酶标显示：凝胶与骨髓间充质干细胞共同培养形成的三维体系中细胞的增殖活力高于凝胶与骨髓间充质干细胞共同培养形成的二维体系。 3、采用Western-Blot方法检测A组、B组、C组中目的蛋白的相对含量，使用单因素方差分析，结果显示：C组中的NSE蛋白、MAP-2蛋白、GFAP蛋白表达量要远高于A组及B组，进行统计学分析，三组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。荧光双标记骨髓间充质干细胞细胞中表达 NSE蛋白的细胞呈现红色荧光，表达GFAP蛋白的细胞呈现绿色荧光。在C组中检测出表达NSE蛋白的红色荧光大约占50%，表达GFAP蛋白的绿色荧光占约30%，而A组， B组中检测到GFAP蛋白和NSE蛋白的表达水平低下。C组中NSE蛋白、GFAP蛋白表达水平明显高于A组、B组，进行统计学分析，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 两亲性肽自组装凝胶具有诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞方向分化。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1健康3周龄的SD大鼠3只,由南昌大学医学院动物中心提供。

2.1.2 老鼠骨髓间充质干细胞从老鼠的胫骨、股骨骨髓中分离提取培养。

2.1.3两亲性肽自行设计后委托上海波泰公司合成。

2.1.4主要实验试剂配置

2.1.5主要试剂

2.1.6实验设备

2.2 实验方法

2.2.1 骨髓间充质干细胞的分离及培养

2.2.2 骨髓间充质干细胞进行鉴定

2.2.3骨髓间充质干细胞向脂肪和软骨方向分化诱导

2.2.4两亲性肽的设计

2.2.5两亲性肽的自组装及检测.

2.2.6 IKVAV两亲性肽凝胶与骨髓间充质干细胞的复合性培养

2.2.7 IKVAV两亲性肽凝胶对骨髓间充质干细增殖/毒性作用

2.2.8 IKVAV两亲性肽诱导骨髓间充质干细胞细胞分化

2.2.9统计学处理

第 3 章 实验结果

3.1 骨髓间充质干细胞的培养与传代

3.2流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记抗原 CD29、CD34、CD45、CD90的表达结果

3.3 骨髓间充质干细胞的成脂、成软骨诱导培养后进行油红 O 染色及阿利辛蓝染色结果

3.4两亲性肽检测及自组装凝胶的检测结果

3.5骨髓间充质干细胞与凝胶复合性培养结果

3.6 凝胶对骨髓间充质干细胞增殖/毒性的影响

3.7 骨髓间充质干细胞向神经方向分化的检测

3.7.1 骨髓间充质干细胞向神经方向分化后神经标志物Western-Blot结果

3.7.2 骨髓间充质干细胞向神经方向分化后神经标志物免疫荧光结果

第 4 章 讨论

第 5 章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

论文综述: 间充质干细胞对脊髓损伤的治疗作用