FAT10调控WISP1表达在肝癌细胞增殖中作用及机制研究

摘要

目的： 探讨WISP1在肝癌中的表达及生物学功能；FAT10调控WISP1对肝癌细胞生物学特性的影响；明确FAT10调控WISP1蛋白表达的机制；明确FAT10通过稳定β-catenin促进WISP1mRNA的表达；明确FAT10导致WISP1蛋白和mRNA表达不一致的机制。最终明确FAT10调控WISP1表达的分子机制及对肝癌细胞生物学特性的影响。 方法： 一、蛋白质谱等检测WISP1蛋白在肝癌组织中的表达水平；单因素和多因素回归分析WISP1表达与患者临床病理特征的关系；生存分析分析WISP1表达与患者总体生存率的关系； 二、改变肝癌细胞系WISP1的表达，检测细胞增殖能力及增殖相关抗原的表达；肝癌细胞株中改变FAT10表达的同时改变WISP1的表达，检测细胞增殖能力及增殖相关抗原表达的改变；改变FAT10表达的同时改变WISP1表达，检测肝癌细胞增殖能力的变化；在敲除FAT10细胞株中回复FAT10表达或者诱导FAT10的表达，检测WISP1蛋白表达的变化； 三、免疫共沉淀（Co-IP）等检测内源性和外源性FAT10和WISP1的结合及共定位；沉默UBA6和USE1表达后，免疫共沉淀检测FAT10-WISP1复合物的改变；构建Flag-FAT10ΔGG突变型的过表达质粒，检测WISP1和FAT10的结合与WISP1蛋白表达水平的变化；分别过表达野生型FAT10和突变型FAT10ΔGG，WB检测WISP1蛋白和mRNA的变化；在肝癌细胞系中过表达FAT10，检测WISP1蛋白和mRNA表达的变化。 四、改变β-catenin的表达，检测WISP1蛋白、mRNA及启动子荧光素酶水平的变化；改变FAT10的表达，检测β-catenin蛋白、WISP1蛋白及mRNA的变化；过表达FAT10同时改变β-catenin的表达，检测β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化； 五、在逐渐过表达FAT10同时加或者不加β-catenin抑制剂，检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化；逐渐过表达FAT10或者FAT10ΔGG，检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化；过表达FAT10或者FAT10ΔGG肝癌细胞注射株裸鼠成瘤，WB、荧光定量PCR免疫组织化学、原位杂交实验检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化； 六、检测新鲜肝癌组织中FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化；分析四者相关性；免疫组织化学和原位杂交检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的表达； 结果： 一、蛋白质谱等结果表明：WISP1蛋白在肝癌肿瘤组织中低表达；进一步分析显示：低WISP1蛋白表达与肿瘤大小、临床分期有显著相关性，低WISP1蛋白表达的患者有着更短的总生存时间；WISP1是肝癌患者预后不良的独立危险因素； 二、WB结果表明在肝癌细胞中WISP1蛋白的表达明显低于正常肝细胞；细胞功能实验及WB结果显示：过表达WISP1降低肝癌细胞的细胞增殖能力及细胞周期蛋白D1和增殖细胞核抗原（PCNA）表达；裸鼠成瘤实验表明，过表达WISP1抑制肝癌细胞的成瘤能力，同时瘤体免疫组化证实Cyclin D1和PCNA的表达明显减少； 三、WB结果显示在肝癌细胞中FAT10蛋白呈高表达，WISP1蛋白低表达；在肝癌细胞中下调FAT10表达增加WISP1蛋白的表达，而过表达FAT10明显降低WISP1蛋白表达；体内和体外实验结果表明，下调WISP1蛋白表达明显抑制低表达FAT10肝癌细胞中WISP1蛋白表达，回复了FAT10低表达导致的肝癌细胞增殖能力的下降；相反，上调WISP1蛋白表达回复了高表达FAT10肝癌细胞中WISP1蛋白表达，抑制了FAT10高表达导致的肝癌细胞增殖能力的升高；此外，在FAT10敲除细胞系中回复 FAT10的表达，WISP1蛋白表达显著减少，诱导FAT10表达，WISP1蛋白表达无明显变化。 四、Co-IP和激光共聚焦结果表明FAT10和WISP1存在相互作用；沉默E1和E2酶的表达，WISP1–FAT10复合物均显著降低，而WISP1蛋白表达增加；野生型FAT10可与WISP1结合并降低WISP1蛋白的表达，FAT10ΔGG不能结合WISP1，却导致WISP1蛋白表达增加；在肝癌细胞系中过表达FAT10增强WISP1mRNA表达，同时降低了WISP1蛋白表达； 五、下调β-catenin蛋白表达降低WISP1 mRNA和蛋白的表达，上调β-catenin蛋白表达导致了相反的结果；进一步的实验表明在肝癌细胞中β-catenin蛋白直接结合到WISP1启动子和调控WISP1表达；过表达FAT10增加β-catenin蛋白表达，β-catenin的mRNA表达无明显变化，而WISP1 mRNA表达增加，下调 FAT10表达出现相反的结果；低表达或抑制β-catenin的表达同时过表达FAT10，WISP1表达下调或无变化。相反，低表达FAT10细胞中的过表达β-catenin，WISP1mRNA表达被回复。 六、不加β-catenin抑制剂，过表达FAT10导致在WISP1蛋白下降和mRNA增加不一致现象，加入则不出现不一致现象；过表达FAT10△GG，WISP1蛋白和mRNA的表达均逐渐升高，也不出现不一致现象；体内实验进一步证实了这一现象；进一步，检测临床标本中FAT10和WISP1蛋白和mRNA表达的相关性，发现FAT10与WISP1蛋白负相关，与其mRNA正相关；而WISP1蛋白负和mRNA表达负相关。 结论： （1）WISP1蛋白在肝癌组织中低表达，过表达WISP1抑制肝癌细胞增殖； （2）FAT10通过FAT10化降解WISP1促进肝癌细胞增殖； （3）FAT10通过稳定β-catenin促进WISP1mRNA的表达； （4）FAT10同时发挥降解和稳定功能导致WISP1蛋白和mRNA表达不一致。

目录

声明

中英文缩略表

前言

第一章 WISP1蛋白在肝癌中低表达并与肝癌患者生存率相关

1.1材料和方法

1.2 结果 WISP1蛋白在肝癌中低表达并与肝癌患者预后密切相关

1.3 讨论

1.4 结论

第二章 明确WISP1蛋白对肝癌细胞生物学活性的影响

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三章 明确FAT10调控WISP1表达影响肝癌细胞增殖生物学活性

3.1材料和方法

3.2结果 FAT10调控WISP1蛋白表达影响肝癌细胞增殖

3.3讨论

3.4结论

第四章 明确FAT10下调WISP1蛋白表达的机制

4.1材料和方法

4.2 结果FAT10降低WISP1蛋白表达是通过fat10化

4.3 讨论

4.4 结论

第五章 FAT10通过稳定β-catenin蛋白表达增加

5.1 材料和方法

5.2结果 FAT10通过稳定β-catenin蛋白表达增加WISP1mRNA的表达

5.3 讨论

5.4结论

第六章 探讨FAT10导致WISP1蛋白/mRNA表达不一致的机制

6.1材料和方法

6.2 结果 FAT10同时发挥稳定和降解底物功能，导致WISP1蛋白/ mRNA表达的不一致

6.3讨论

6.4结论

全文总结

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:WISP1及其家族的生物学功能