蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中LDC和CAO基因的克隆及表达

摘要

石杉碱甲（Huperzine A, HupA）是治疗阿尔茨海默症的生物碱类药物。由于化学合成、石松属植物栽培及细胞培养等生产技术无法突破， HupA仅能从野生蛇足石杉等石松属植物中提取，存在原料短缺和环境破坏等严重问题，内生真菌发酵生产 HupA成为可供选择的替代方式。生物合成途径的阐明是采用基因组学、代谢工程、组合生物合成等现代生物技术生产代谢产物的基础，但HupA等石松生物碱生物合成途径尚未阐明。本研究以高产HupA的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14为对象，对全基因组测序和生物信息学分析预测的编码石杉碱甲生物合成中第一、二步反应的关键酶—赖氨酸脱羧酶（ Lysine decarboxylase, LDC）和铜胺氧化酶（copper amine oxidase, CAO）基因，开展其体外功能分析。
　　根据全基因组序列信息获得的 LDC序列信息，本研究采用 RT-PCR技术，从 Shiraia sp. Slf14中扩增得到长度为687 bp的 LDC基因(GenBank ID:KT362170)，并成功构建大肠杆菌表达质粒 pET-22b-LDC与 pET-32a-LDC，转化感受态细胞 E. coli BL21(DE3)，诱导表达出重组蛋白 LDC与 Trx-LDC。经SDS-PAGE电泳鉴定分子量分别约24 kDa和42 kDa，与预计大小相符。通过Ni2+金属亲和层析纯化重组 LDC与 Trx-LDC并建立酶促反应体系，利用 TLC检测 LDC催化活性，结果表明 LDC与 Trx-LDC均具有赖氨酸脱羧酶活性。利用生物信息学软件分析了 LDC的理化性质及蛋白质的空间结构：二级结构显示出α螺旋占37.3％，β折叠占11.4%，无规则卷曲为51.3%；从三维结构看出LDC为二聚体结构， N端肽链暴露在蛋白表面，主要通过C端肽链相互作用形成二聚体。基于赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列系统进化树分析可知， Shiraia sp. Slf14的LDC与来源于Aspergillus clavatus NRRL1的相应蛋白的氨基酸序列相似度最高，和来自宿主植物Huperzia serrata的两个LDC差异较大。
　　基于全基因组序列信息获得的CAO基因相关信息，采用RT-PCR技术扩增得到铜胺氧化酶(SsCAO)基因，基因长度2031 bp，序列已提交至 NCBI数据库(GenBank ID: KT362171)。成功构建大肠杆菌表达载体pET-SsCAO并转化感受态细胞 E. coli BL21(DE3)，经诱导表达出76 kDa大小的重组 SsCAO蛋白质，与预测大小相吻合。重组 SsCAO经纯化后构建酶促反应体系，GC-MS检测发现了产物5-氨基戊醛（5-aminopentanal），表明重组 SsCAO具有催化活性。通过生物信息学分析其理化性质和预测蛋白质的结构，SsCAO蛋白质二级结构和三维结构显示α-螺旋较集中于 C/N两端，β-折叠结构所占比例较大。分析SsCAO的氨基酸序列发现，其含有 CAO家族的保守序列 Asn-Tyr-Asp/Glu， His447、His449、His607和 Tyr299, Lys309 and Asp313。系统发育树分析表明SsCAO与匐柄霉属 Stemphylium lycopersici CAO关系最近，与 H. serrata CAO和其他的植物 CAOs相距较远。本文对 LDC和 SsCAO的研究不仅为内生真菌石杉碱甲生物合成机制提供参考数据，同时也为 HupA的合成生物学研究奠定基础。

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第1章文献综述

1 .1蛇足石杉的特征及分布

1.2植物内生真菌概述

1.3石杉碱甲概述

1.4 本课题研究意义与内容

第2章实验材料与方法

2. 1实验材料及试剂

2.2实验方法

第3章Shiraia sp. Slf14中赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析

3.1 Shiraia sp. Slf14中赖氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

3.2重组赖氨酸脱羧酶的活性鉴定

3.3赖氨酸脱羧酶的理化性质分析

3.4赖氨酸脱羧酶的高级结构预测及系统发育树分析

3.5本章小结与讨论

第4章Shiraia sp. Slf14中铜胺氧化酶基因的克隆、原核表达及其功能分析

4.1 Shiraia sp. Slf14铜胺氧化酶基因的克隆和表达

4.2重组SsCAO的功能表征

4.3 SsCAO生物信息学分析

4.5本章小结与讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

在读期间公开发表论文（著）及科研情况