几种检测氧化还原活性小分子荧光探针的设计合成与应用研究

摘要

荧光检测法具有分辨率高、选择性好、操作简单等优良特点，是用于检测细胞内生物活性分子的有效工具之一。小分子荧光探针的设计与应用是当前荧光检测的热门领域。目前报道的部分探针在小分子检测方面仍存在一些不足之处，比如：水溶性差、合成繁琐、抗干扰能力差、发射波长短等，因此还有待进一步开发能克服上述问题的新型小分子荧光探针。针对目前探针的一些性能缺陷，本论文旨通过荧光团分子的结构调控与优化以构建出合成简单、水溶性好，比率式响应、具有较大斯托克斯位移值及（或）具有近红外荧光发射等优点的荧光探针，并以此来实现了对几种重要氧化还原活性小分子的检测，进行了生物成像应用研究，具体内容如下： （1）香豆素及其衍生物荧光分子具有合成便利、官能团易调控、光谱性质优良等特点。本论文通过在香豆素骨架分子中引入羟基而改善探针分子的水溶性，此外，在合成过程中，用8-羟基久洛尼定来取代3-羟基-N,N-二乙基苯胺，得到了发射波长更长的水溶性香豆素荧光团。并将改进的荧光团进一步偶联上2,4-二硝基苯磺酰基酯（DNBS）识别部分得到了一种增强型Cys（Cysteine，半胱氨酸）的荧光探针。该探针能够在单一的水相缓冲溶液中实现对Cys的检测，达到52倍的增强型荧光响应。该探针对Cys具有高的选择性，且不受谷胱甘肽的影响，该探针的灵敏度高，检测限低达23nM。细胞毒性和成像测试表明，探针分子生物兼容性好，可用于活细胞中Cys的成像分析。 （2）以第（1）部分中获得的香豆素衍生物为荧光团、乙酰酯基为识别基团，合成一种用于肼检测的比率式探针。该探针分子具有良好的水溶性，在单一水相的磷酸盐缓冲液中呈现青色荧光发射。在肼的存在下，探针分子的乙酰基被肼解，释放出香豆素衍生物荧光团，呈现出蓝色荧光发射，从而实现了比率式的荧光响应。该探针对肼表现出了高的选择性与灵敏度，检测限为34nM。该探针能够实现细胞内肼的成像分析。 （3）针对激发波长与发射波长靠近容易产生干扰的问题，基于吩噻嗪荧光骨架分子构建了一种新型的具有较大斯托克斯（117nm）位移值的发绿光的硫醇荧光探针。响应机理为硫醇诱导探针中2,4-二硝基苯磺酸盐基团的裂解，从而消除了光诱导电子转移（PET）过程，释放绿色荧光母体染料，从而实现了“Off-On”型高效的生物硫醇的荧光检测。该探针对生物硫醇的检测具有良好的选择性和高的灵敏度，检测限为0.12μM，共聚焦荧光成像实验表明该探针可成功应用于活细胞内生物硫醇的检测。 （4）基于比率式荧光探针能克服因探针分布不均而带来的信号干扰，以及用于过氧化苯甲酰（BPO）检测的探针的缺陷，本论文通过将芳基硼酸酯的识别单元与苯并噻唑衍生荧光团偶联，构建了一种新型的BPO比率式荧光探针。探针溶液为无色，在460nm处显示弱蓝色荧光。加入BPO后，芳基硼酸酯取代基可通过氧化和1,4-消除反应除去，释放在545nm处有强黄绿色荧光发射的荧光团。探针对BPO具有较高的选择性和灵敏性。检测线性范围为1~75μM，检测限为0.26μM。此外，该探针成功用于了小麦粉和抗菌乳膏中BPO的定量检测。细胞实验也表明该探针可以有效地用于活体细胞中BPO的成像分析。 （5）近红外荧光探针具有生物组织穿透能力强、对生物体损害小等优点，且具有大斯托克斯位移值的荧光探针能进一步降低光谱背景干扰。本论文将二氰基化的异氟尔酮吸电子基团与4-(二乙氨基)水杨醛偶联，合成了一种具有近红外光发射特征（λmax=693nm）、且斯托克斯位移值较大（133nm）的荧光染料；通过进一步偶联上2,4-二硝基氟苯，得到了一种近红外的用于苯硫酚检测的增强型荧光探针。该探针对目标检测物具有良好的选择性，其它巯基化合物（如硫醇、硫化氢）不能引起明显的荧光强度变化。该方法对苯硫酚的检测限为17nM。此外，该探针能够用于细胞中苯硫酚的成像分析。

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致谢

变量注释表

1 绪论

1.1 小分子荧光探针的简介

1.2 生物巯基化合物荧光探针研究进展

1.3 肼的荧光探针

1.4 BPO荧光探针的研究进展

1.5 苯硫酚荧光探针的研究进展

1.6 本文的设计思路

2 基于香豆素骨架的荧光探针的设计、合成及在 Cys检测中的应用

2.1 引言

2.2 实验

2.3 结果与讨论

2.4 结论

3 基于香豆素骨架的荧光探针对N2H4的检测

3.1 引言

3.2 实验

3.3 结果与讨论

3.4 结论

4 基于吩噻嗪骨架的具有大斯托克位移值的硫醇探针的合成与应用

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 结论

5 基于苯并噻唑骨架的荧光探针的设计、合成及在BPO检测中的应用

5.1 引言

5.2 实验

5.3 结果与讨论

5.4结论

6 近红外荧光探针的设计、合成及在苯硫酚检测中的应用

6.1 引言

6.2 实验部分

6.3 结果与讨论

6.4 结论

7 结论

参考文献

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