抗BovIFN-gamma特异性单克隆抗体的研制及其特性

摘要

利用IPTG诱导大肠杆菌表达GST-BovIFN-γ融合蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,切取融合蛋白条带制成冻干粉作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,研制抗BovIFN-γ的单克隆抗体(McAb).以表达GST-BovIFN-γ融合蛋白的重组大肠杆菌超声波裂解上清作为检测抗原,表达空载体GST蛋白的大肠杆菌超声波裂解上清作为对照检测抗原,用间接ELISA方法进行检测,筛选只与表达GST-BovIFN-γ融合蛋白的重组菌裂解液作为包被抗原反应而不与表达GST的非重组菌裂解液作为包被抗原反应的杂交瘤细胞上清,然后利用其它检测方法进一步鉴定单抗的特异性.结果筛选出2株分泌抗rBovIFN-γ抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为BovIFN-γ-4A3与BovIFN-γ-4G5.将两株杂交瘤细胞株分别采取有限稀释法连续亚克隆多次,直到检测100％细胞阳性孔,然后将此细胞株进行冻存及制备腹水.间接ELISA分析结果表明,单抗BovIFN-γ-4A3效价较高,腹水效价可达到1:1.3×10<'7>,单抗BovIFN-γ-4G5效价1:25600.Western-blot试验结果证明,单抗BovIFN-γ-4A3与BovIFN-γ-4G5均能与IPTG诱导的重组菌裂解物反应,在融合蛋白GST-BovIFN-γ呈现明显条带,而不能与大肠杆菌表达的重组鸡IFN-γ反应.间接免疫荧光试验(IFA)结果发现,单抗BovIFN-γ-4A3与感染重组杆状病毒Bacmid-BovIFN-γ的Sf9细胞反应,出现特异性亮绿色荧光;中和试验结果证明,单抗BovIFN-γ-4A3对rBovIFN-γ的抗病毒活性有一定程度的中和作用.用捕获ELISA进行单抗的亚类鉴定,证明单抗BovIFN-γ-4A3 Ig亚类为IgG2b,单抗BovIFN-γ-4G5 Ig亚类为IgM.这些结果表明,2株单抗均是针对牛的IFN-γ的特异性单克隆抗体,而不与其他抗原(如GST,重组鸡IFN-γ)反应.为使获得的2株单抗得到更好的应用,将单抗BovIFN-γ-4A3用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP),作为酶标抗体,单抗BovIFN-γ-4G5作为固相包被抗体,重组牛IFN-γ(GST-BovIFN-γ)作为检测抗原,建立一种夹心ELISA方法检测rBovIFN-γ.实验结果表明,此法特异性及其敏感性良好,可以进一步应用于rBovIFN-γ的检测.

目录

符号说明

文献综述

研究内容 抗奶牛干扰素-Y特异性单克隆抗体的研制及其特性研究

1材料

2方法

3结果

4小结与讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章