人细胞中hIWS1因子生物学特性的研究

摘要

第二类RNA聚合酶(RNApolymeraseⅡ，RNAPⅡ)主导的基因转录过程中，转录延伸是一个高度调控的过程，其中涉及许多的调控因子参与RNAPⅡ活性的调控。目前已经有许多的RNAPⅡ转录延伸因子被鉴定，但仍有不少的因子处于待了解状态，酵母方面的研究认为IWS1是一个新的RNAPⅡ转录延伸因子。本研究在人细胞中鉴定了hIWS1(humanIWS1)因子，并且在此基础上，对hIWS1的一些生物学特性进行了研究。另外，PRMT5是蛋白质精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferases,PRMTs)家族中一个重要的成员，它能够对精氨酸(R)进行单甲基化和对称性双甲基化翻译后修饰。最近有研究发现PRMT5能参与RNAPⅡ转录表达调控。为此，本研究探索了人细胞中hIWS1与PRMT5的关系。 1.hIWS1的克隆、表达与鉴定 1.1从人的293T细胞中提取总RNA，将其中的mRNA反转录成为第一链cDNA作为PCR扩增hIWS1cDNA的模板。然后根据GenBank中所预测的hIWS1的cDNA序列(登录号：AL834178)设计相应的PCR引物。利用这些特异性的引物，本研究扩增得到hIWS1的N端(hIWS1-N391)和C端(hIWS1-C297)编码cDNA，然后利用这两个cDNA片段获得了全长hIWS1，经测序证明克隆得到的hIWS1序列与GenBank中AL834178的序列完全一致。这表明人细胞中存在成熟的hIWS1的mRNA，并且mRNA成熟过程中的剪接机制符合GenBank中所预测的情况。 1.2根据AL834178所预测的开放性阅读框(openreadingframe，ORF)，将hIWS1-N391克隆到pET-22b形成表达重组质粒pET22b-N391，然后将pET22b-N391转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果表明，在大肠杆菌BL21(DE3)中pET22b-N391的表达产物主要在上清中；并且IPTG诱导以后，pET22b-N391在16℃表达16h能够产生更高的产量。 将大肠杆菌破碎液的上清加入到Ni-NTA纯化柱中，然后用含20mM咪唑的PBS充分洗涤后，最后用含100mM咪唑的PBS能纯化得到质量较好的pET22b-N391。 1.3将纯化得到的hIWS1-N391蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体，该抗体特异地识别AL834178所预测蛋白上的第3至391位氨基酸。用该抗体对HCT116细胞中总蛋白进行western杂交实验，结果有两个蛋白被特异性地识别，其中信号最强的蛋白大小约92kDa，与AL834178所预测蛋白的分子量一致。该结果证明人细胞中存在hIWS1蛋白因子，并进一步表明该因子严格地遵循GenBank中AL834178所预测的ORF。 2.小鼠Iwsl(mIws1)的组织表达分析 由于hIWS1与它的小鼠同源物(mouseIWS1，mIWS1)具有很高的同源性(84％的相似性)，因此本研究利用小鼠为实验对象研究动物中IWS1的组织表达分布情况。首先从小鼠体内分离出有关器官组织，其中包括大脑、心脏、肝脏、肺、脾脏、胃、肾脏、前列腺、睾丸、子宫、大肠与小肠。接着将这些器官组织中的总RNA提取出来并反转录成cDNA，然后以这些cDNA为模板进行半定量RT-PCR分析。结果表明mIWS1是个组织器官普遍性表达的因子；并且在不同器官组织中的表达量差异较大，其中肾脏中表达量最高，其次是睾丸、大肠、小肠与脾脏，而心脏中的表达量最低。这些结果意味着IWS1对于动物机体是个必需因子，并且它的功能具有组织偏好性。 3.hIWS1的亚细胞定位 3.1将hIWS1的全长cDNA构建到绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1中，然后将该重组质粒瞬时转染HCT116和U2OS细胞。荧光显微镜观察结果表明GFP-hIWS1在细胞中表达后主要定位在细胞核中，说明hIWS1因子是个核蛋白。 3.2针对hIWS1的核蛋白特性，对hIWS1因子的肽链序列进行分析，结果发现在hIWS1因子的两个功能域的衔接区(第350至557位氨基酸之间)有几个类似核定位信号(nuclearlocalizationsignals，NLSs)的基序。为了检验这个衔接区是否具有NLSs作用，将hIWS1cDNA的各种缺失突变体构建到绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1中，然后将这些重组质粒分别转染HCT116。荧光共聚焦显微镜观察结果表明GFP-N391分布在细胞核内，而GFP-N355主要分布在细胞质中，这些结果表明在hIWS1因子的第356位至第391位氨基酸之间含有NLSs。类似地，GFP-C389定位在细胞核内，而GFP-△WT(缺失第356至524位氨基酸)却同时分布在细胞核与细胞质内，这些结果表明hIWS1因子第389位氨基酸至第524位氨基酸之间也含有NLSs。 4.hIWS1因子对细胞生长的影响 4.1参考AL834178的cDNA序列选择3个靶序列，并设计成shRNA引物，然后将合成的引物克隆到shRNA表达载体pNeoU6+1上构建成RNAi重组质粒，分别命名为sh1，sh2和sh3。为了粗略地估计这几对shRNA的RNAi效果，将GFP-WT分别与sh1，sh2，sh3和空白对照shLF共转染HCT116，结果表明这3对shRNA都具有RNAi效果，不过sh2的RNAi效果较弱，而sh1和sh3却能够很有效地抑制细胞中hIWS1的表达。 4.2用以上各种shRNAs和对照质粒shLF转染HCT116细胞，然后进行细胞克隆试验。结果表明与对照shLF组相比，sh2组的细胞克隆数量略少；而sh1和sh3组的细胞克隆数量却剧烈减少，并且所生长的细胞克隆形态较小。Western杂交实验表明各组试验中细胞克隆的差异是由于细胞中hIWS1因子被特异地抑制所引起的。这些结果证明细胞中hIWS1因子表达量降低后会降低细胞的存活能力和生长能力，表明hIWS1因子是细胞生存的必需因子。 5.hIWS1和PPMT5的关系 5.1用抗PRMT5抗体与抗hIWS1抗体对HCT116细胞中的总蛋白进行免疫共沉淀实验，然后用抗hIWS1抗体对免疫共沉淀结果进行western杂交检验。结果表明抗PRMT5抗体与抗hIWS1抗体都能沉淀分离出hIWS1因子，并且这种沉淀分离是特异的，因为空白对照和免疫前血清均不能将hIWS1因子沉淀出来。这些结果表明人细胞中hIWS1和PRMT5之间存在物理性结合。 5.2将抑制hIWS1表达的sh1、抑制PRMT5表达的shRM5以及对照shLF转染HCT116细胞，然后分别用抗hIWS1抗体和抗PRMT5抗体进行Western杂交检验。结果表明当细胞中hTWS1因子表达量受抑制后，PRMT5的表达量也降低；而当细胞中PRMT5被沉默后，hIWS1因子的表达量却较对照上调。这些结果表明人细胞中hIWS1的表达与PRMT5的表达相互关联，二者之一对另一个因子的表达具有调控作用。

目录

文摘

英文文摘

缩略词说明

第一章关于RNAPⅡ转录延伸的研究进展

第二章人细胞中IWS1(hIWS1)因子的鉴定

第三章小鼠Iws1(mIws1)的组织表达分析

第四章HIWS1的亚细胞定位

第五章hIWS1对细胞生长的影响

第六章hIWS1和PPMT5的关系

主要参考文献

全文结论

致谢

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