苜蓿根瘤菌内切β-1，4-葡聚糖酶EndS-1在Escherichia coli和Pichia pastoris中表达及定位点突变的研究

摘要

纤维素是植物纤维的主要成分，约占其干重的30-50％，是目前分布最广的天然碳水化合物，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。随着世界人口的激增、粮食和能源的短缺将日趋严重，可再生纤维素资源的开发利用已引起全世界的普遍关注。纤维素酶是能降解纤维素为葡萄糖等简单糖类的一类酶系。现在虽然已发现众多生物可以产生纤维素酶，包括低等动物、植物、真菌、细菌和放线菌，有的纤维素酶，特别是来源于丝状真菌(如木霉、黑曲霉)纤维素酶已被广泛地应用在食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等众多领域，但是发现新的纤维素酶，研究它们能否在工业化表达系统中高效表达，能否进行改造，研究是否具有应用价值仍然是十分必要的。 几年前，来源于苜蓿根瘤菌(SinorhizobiummelilotiM5NICS)的内切β-1，4-葡聚糖酶EndS基因被克隆鉴定出来，并成功地在大肠杆菌中表达，但表达量不高。为了研究EndS基因能否在大肠杆菌或高等真菌表达系统中高效表达，我们首先采用了大肠杆菌组成型表达系统来表达EndS基因，并进行了培养条件优化，结果表达量也不高。我们表达的是一个有3个氨基酸残基不同于EndS酶的突变体EndS-1。通过对EndS-1性质研究表明，突变体EndS-1在60℃、pH6.4-7.0活力最高，比活力达23.44IU/mg；在60℃、pH7.0，酶的半衰期为6.28小时。为了进一步探讨EndS-1基因能否在真核细胞中高分泌表达，我们选择了甲醇酵母表达系统来探讨EndS-1在此系统中的表达情况。通过基因克隆，表达载体的构建，转化，成功地在Pichiapastoris表达了EndS-1基因。EndS-1基因在甲醇酵母表达系统中基本表达30毫克/L以上，表达产物为分子量相差1K左右的两种修饰糖蛋白(EndS-1a和EndS-1b)。通过对纯化的表达产物进行酶学性质研究，同大肠杆菌表达的产物酶学性质进行了比较表明糖基化对EndS-1的性质有所影响：EndS-1b的比活力、稳定性与大肠杆菌表达的EndS-1相比略有降低，而EndS-1a却降低很多. 通过分子模建分析表明，EndS-1被修饰的糖基化位点不在催化活性中心区域。为解决糖基化对EndS-1的性质有所影响，本文通过N-糖基化位点突变，我们得到电泳鉴定条带呈均一性的突变体EndS-2和EndS-4。突变结果表明EndS-1a为N-型糖基化修饰，其修饰位点在残基222处。对突变体的性质研究我们还发现EndS-2的比活力为20.39IU/mg，和EndS-1与EndS-1b相当;EndS-4的比活力为106.67IU/mg，但稳定性较差。此结果表明我们可以用EndS-2来研究其在甲醇酵母中的表达量，同时也说明对EndS-1酶的改造具有很大的可能性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写表

引言

第一章 苜蓿根瘤菌内切β-1,4-葡聚糖酶EndS-1在大肠杆菌中的表达

第二章 内切β-1,4-葡聚糖酶EndS-1在Pichia pastoris中的表达、纯化与性质的研究

第三章 在Pichia pastoris中表达的内切β-1，4-葡聚糖酶EndS-1糖基化预测和结构同源模建分析

第四章 内切β-1，4-葡聚糖酶EndS-1的N-糖基化位点突变和突变体的表达与性质研究

第五章 结论与展望

参考文献

附录

攻读学位论文期间发表的学术论文

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