莱克多巴胺单克隆抗体的研制及其ELISA检测方法的建立

摘要

莱克多巴胺 (Ractopamine，Rac)是一种β<,2>-肾上腺素能兴奋剂，因具有营养再分配、促进蛋白质合成，增加动物酮体瘦肉率，提高饲料转化率的作用，可能被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产，但其残留对人类健康存在潜在的危害，被禁止或限定存畜产品生产中使用。本研究旨在制备特异性针对莱克多巴胺的单克隆抗体，并建立竞争酶联免疫吸附法(cELISA)用于Rac的残留检测。 将阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)和半抗原Rac进行偶联，经紫外光谱扫描确定偶联成功，测定偶联物的蛋白浓度为0.70 mg/ml。以此偶联物Rac-cBSA作为免疫原，与试剂盒自带佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，每次免疫间隔2周，待血清抗体效价明显升高后加强免疫，3天后取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。旧时用混合酸酐法将Rac与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联。以偶联产物Rac-OVA作为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出阳性细胞株，再用有限稀释法进行多次亚克隆，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5D<,2>和6B<,3>。经亚类鉴定其免疫球蛋白亚类均为IgM，单抗腹水的间接ELISA效价分别为2×10<'5>和1×10<'5>。该细胞株经体外培养、传代、冻存和复苏后抗体性质稳定。特异性鉴定结果显示，单抗与Rac的类似物盐酸克伦特罗及两种偶联载体均不发生交叉反应。采用 cELISA试验鉴定单抗的敏感性，68<,3>的IC<,50>为0.01ng/ml，5D<,2>的IC<,50>为0.1ng/ml。说明单克隆抗体具有较好的亲和性。 将ELISA检测条件进行了优化，得到的最佳反应条件为：包被时间37℃作用3h，封闭条件为37℃作用3h，封闭液选用1％明胶。用方阵滴定法确定最适包被抗原稀释倍数为1:1600，单抗的最适稀释倍数为1:8000，采用cELISA方法建立检测Rac的标准曲线，在0.1ng/ml-100ng/ml范围内呈线性相关，回归方程为Y=-0.4052X+0.0111，相关系数R<'2>=0.9815。用cELISA法检测Rac有着良好的应用前景，但是试剂盒的组成元件和条件还需要进一步探索，最佳反应条件还需要进一步优化。

目录

论文说明：符号说明

Abstract

文献综述

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

参考文献

致谢