通过代谢工程提高稻米游离赖氨酸含量的研究

摘要

植物是人类和牲畜所消耗的蛋白质的主要来源，但其营养品质往往不够完全。一般来说，禾谷类作物种子蛋白质中的赖氨酸和色氨酸含量低。稻米所含能量高，其中的贮藏蛋白易被消化吸收，但其含量偏低，赖氨酸含量也较缺乏，是稻米蛋白质中的第一限制必需氨基酸。所以，提高稻米中的赖氨酸和蛋白质含量，平衡其营养品质，一直是遗传育种学家追求的目标之一。在对高等植物赖氨酸代谢过程认识的基础上，可设计对水稻种子中赖氨酸合成和降解途径分枝点上关键酶的表达进行调控研究，探求最大限度提高稻米中游离赖氨酸含量的可能途径：具体策略包括通过超表达对赖氨酸反馈抑制不敏感的赖氨酸合成酶关键基因AK(编码天冬氨酸激酶)和DHPS(编码二氢吡啶羧酸合酶)，增加赖氨酸的合成；通过反义RNA或RNA干扰抑制水稻中分解赖氨酸关键酶基因LKR/SDH(编码赖氨酸酮戊二酸酯还原酶/酵母氨酸脱氢酶)的表达，减少水稻籽粒中赖氨酸的分解。本研究即是在本实验室已获得含赖氨酸代谢相关基因转基因水稻的基础上，分析比较不同转基因结构或组合对提高水稻籽粒中游离赖氨酸含量的效果，评价通过代谢工程提高赖氨酸含量后对稻米中其他氨基酸和品质性状以及植株生长等的影响。主要研究内容及结果如下： 1、为了解水稻LKR/SDH基因的表达调控，通过对GUS活性的定性与定量分析，比较研究了由水稻LKR/SDH基因不同长度启动子片段控制的GUS融合基因在转基因水稻植株不同组织中的表达。结果表明，翻译起始密码子ATG上游3.9kb的启动子控制的GUS基因在转基因水稻种子胚乳、叶和茎等多个组织中都能表达，但表现出一定的胚乳特异性。该基因5'端不同缺失长度启动子的表达特性不同，ATG上游2.9或2.Okb长启动子驱动GUS报告基因表达的能力要弱于3.9kb的，但1.6kb长启动子-GUS融合基因的表达活性最高，而且并不表现出组织特异性，说明在该基因ATG上游1.6至3.9kb区域内含有负责其精细表达的顺式调控元件。 2、在含不同赖氨酸代谢相关基因的转基因植株自交后代中，通过对目的基因的PCR和Southern杂交检测等技术，选育获得了较多的转基因纯合系和4个无潮霉素抗性选择标记基因的转基因新品系。Northern杂交表明，在水稻Gtl启动子或CaMV35S启动子控制下，来源于大肠杆菌的AK和DHPS基因在大多数转基因水稻的发育种子能高效表达，导入LKR/SDH基因的RNAi结构后可明显抑制转基因水稻中内源LKR/SDH基因的表达。 3、测定并比较了各类转基因水稻成熟种子中的氨基酸含量，结果表明导入不同赖氨酸代谢相关基因及其组合对提高稻米游离赖氨酸含量的效果明显不同。只导入AK和DHPS基因的转基因稻米中游离赖氨酸含量变化不大；导入LKR/SDH-RNAi结构后稻米中游离赖氨酸含量可提高5-7倍；而同时导入3个基因的转基因稻米中游离赖氨酸含量提高幅度最大，最高的可比未转化对照高50倍。在游离赖氨酸含量提高幅度较大的转基因植株稻米中，总赖氨酸含量也有显著的提高，最高的可比未转化对照提高49％。 4、导入不同赖氨酸代谢相关基因后，对转基因稻米中的总氨基酸和总蛋白质含量没有产，上显著的影响。但是，在游离赖氨酸含量提高幅度较大的转基因稻米中，其它游离氨基酸的含量也发生了一定的变化，表现为与赖氨酸合成相关的天冬氨酸、苏氨酸等的游离态含量有不同程度的下降。 5、与未转化受体亲本相比，大多数转入赖氨酸代谢相关基因的转基因植株成熟种子的外观品质、主要理化品质和田间农艺性状等并没有发生明显的变化。但是，在游离赖氨酸含量显著提高的部分转基因水稻中，其成熟籽粒的外观品质变差、直链淀粉含量降低、胶稠度变软、淀粉粘滞性谱变低，并对籽粒重也有一定的负效应。

目录

论文说明:符号说明

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摘要

1前言

1.1改良植物种子中营养品质的方法概述

1.1.1蛋白质序列的修饰

1.1.2人工合成优质蛋白基因

1.1.3异源优质蛋白基因的转移和过量表达

1.1.4同源优质蛋白基因的过量表达

1.1.5增加游离的必需氨基酸的含量

1.1.6基因工程技术提高水稻种子中赖氨酸含量的研究进展

1.2高等植物中赖氨酸的生物合成与分解代谢

1.2.1赖氨酸的合成代谢途径

1.2.2赖氨酸的分解代谢途径

1.3代谢工程提高植物中赖氨酸含量的研究进展

1.3.1增加赖氨酸的生物合成

1.3.2降低赖氨酸的生物分解

1.3.3增加赖氨酸的生物合成，同时降低赖氨酸的生物降解

1.3.4提高植物中赖氨酸含量的其他途径

1.3.5植物中赖氨酸含量增加后的负效应

1.4本研究的主要目的

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2 PCR引物

2.1.3化学试剂

2.2水稻总DNA和总RNA的提取

2.2.1微量总DNA的提取

2.2.2大量总DNA的提取

2.2.3总RNA的提取

2.3潮霉素抗性鉴定

2.4 PCR分析

2.5地高辛标记DNA探针的制备

2.6 Southern杂交分析

2.7 Northern杂交分析

2.8 GUS活性分析

2.8.1组织化学染色分析

2.8.2荧光定量测定

2.9稻米样品的前处理

2.10水稻种子氨基酸含量分析

2.11稻米垩白度的测定

2.12稻米理化品质性状的测定

2.12.1直链淀粉含量的测定

2.12.2胶稠度的测定

2.12.3糊化温度的测定

2.12.4淀粉粘滞性谱(RVA)的测定

2.13种子蛋白质含量的测定

2.13.1凯氏定氮法测定

2.13.2近红外光谱法测定

2.14田间性状调查

3结果与分析

3.1水稻赖氨酸降解关键酶基因LKR/SDH启动子的表达特性

3.1.1纯合转基因水稻植株的筛选及其鉴定

3.1.2 3.9-kb长启动子驱动的GUS融合基因的表达特性

3.1.3不同长度缺失的启动子-GUS融合基因的表达特性

3.2含赖氨酸代谢相关基因转基因纯合系的选育及鉴定

3.2.1转基因水稻的分子鉴定及纯合系筛选

3.2.2无抗性选择标记转基因水稻的筛选及鉴定

3.3转基因水稻胚乳中目的基因的表达

3.4转基因稻米中的赖氨酸含量

3.4.1转AK和DHPS基因成熟种子中的赖氨酸含量

3.4.2转LKR/SDH RNAi结构成熟种子中的赖氨酸含量

3.4.3同时转入AK/DHPS基因和LKR/SDH RNAi基因成熟种子的赖氨酸含量

3.5转基因稻米中其他氨基酸和蛋白质含量的变化

3.5.1总氨基酸含量和总蛋白质含量的变化

3.5.2对种子中其他氨基酸含量的影响

3.6转基因水稻成熟种子的外观品质表现

3.7转基因植株成熟稻米的理化品质

3.7.1常规理化品质表现

3.7.2稻米淀粉的粘滞性谱特性

3.8田间实验与农艺性状

4小结与讨论

4.1研究小结

4.2来源于大肠杆菌的AK和DHPS基因的共同表达

4.3降低LKR/SDH基因的表达以提高游离赖氨酸的含量

4.4 AK、DHPS基因和LKR/SDH RNAi基因的共同表达

4.5研究展望

参考文献：

致谢