人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及其表达产物活性检测

摘要

人溶菌酶(human lysozyme，hlyz)是一种碱性球蛋白，由130个氨基酸组成，分子量为14.7KD。它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4.β-N溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它做为一种无残留、无耐药性的新型抗菌药物，代表着未来抗菌药物应用和发展方向。 本研究扩增携带重组pGEM-hlyz质粒阳性工程菌，用限制性核酸内切酶Xhol分别酶切处理pGEM-hlyz重组质粒和杆状病毒转移载体pFastBacl，将目的片段进行电泳、胶回收和连接。将连接子转化DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆菌株，提取质粒，并以Xhol和pstl酶切鉴定hlyz插入pFastBacI的方向，将正向插入的连接子，命名为pFastbacI-hlyZ。 将pFastBacI-hlyz重组质粒按Bac-to-Bac表达系统操作步骤转化DH10Bac感受态细胞，纯化培养三代，挑取白色菌落提取基因组DNA，并hlyz特异引物和M13通用引物对重组质粒进行PCR鉴定，阳性质粒常规方法转染Sf9细胞，收取显著病变的细胞，即P1代病毒，命名为rBac-hlyz，同时以野生杆状病毒感染Sf9细胞作为阴性对照。感染96～120h后，用免疫荧光技术(IFA)方法对P3代重组杆状病毒rbac-hlyz感染Sf9细胞进行检测，观察到特异性的荧光，而阴性对照则无。用SDS-PAGE及Westem Blot方法对P3代重组杆状病毒rbac-hlyz感染Sf9细胞培养上清进行检测，观察发现有符合预测大小的14.7KD蛋白质条带，阴性对照则此无特异条带。通过以上两个试验，表明我们获得了重组人溶菌酶蛋白。 用溶壁微球菌制备含有微球菌的琼脂平板，进行琼脂平板扩散试验检测重组人溶菌酶蛋白的活性。结果显示P4代rbac-hlyz重组毒感染的Sf9细胞培养上清孔内得到了约20mm抑菌圈，细胞裂解上清孔得到了约11mm的抑菌圈，标准蛋清溶菌酶溶液孔内得到了约12mm的抑菌圈。阴性对照孔内无抑菌现象。 针对临床上常见金黄色葡萄球菌大肠杆菌，我们应用琼脂平板扩散试验检测thlyz对二者的溶菌活性。结果发现，对于金黄色葡萄球菌，P4代rbac-hlyz重组毒感染的Sf9细胞培养上清孔内得到了约15mm的抑菌圈，细胞裂解上清孔得到了约llmm的抑菌圈，标准蛋清溶菌酶溶液孔内得到了约8mm的抑菌圈。而阴性对照孔内没有抑菌现象。而对于大肠杆菌，标准蛋清溶菌酶得到了大约9mm的抑菌圈，而P4代rbac-hlyz重组毒感染的Sf9细胞培养上清孔内得到了约只有2mm的抑菌圈。表明本研究重组表达所获得的人溶菌酶具有很强抑制革兰氏阳性细菌的生物学活性，而对革兰氏阴性菌效果不理想。这是首次利用杆状病毒表达的具有活性人溶菌酶，为日后进一步研究及工业化生产人溶菌酶奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明、计量单位

声明

第一部分 文献综述 溶菌酶研究进展

第二部分 研究内容 人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及其活性检测

1材料与方法

2结果

3.讨论

参考文献

研究成果小结

已发表论文

致谢