长穗偃麦草E组染色体特异PCR标记开发

摘要

植物基因组中存在着大量的重复序列，在小麦中约占基因组的75％。植物基因组在进化过程中通过非同源重组、非等位交换等作用，使DNA水平积累了不同类型的重复序列，形成了组别或种间差异的特异性重复序列。分离这些重复序列不仅可以作为研究麦种进化中遗传组分相互渗透的分子工具，而且还可以利用其丰富多样性发展新的分子标记，进行基因定位、丰富遗传图谱等研究。长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)是小麦重要的野生近缘植物之 一，具有很多优良性状，是对普通小麦进行遗传改良最有利用价值的野生物种之一。利用长穗偃麦草与小麦杂交相继培育了小麦.长穗偃麦草二体附加系和代换系，以便于长穗偃麦草的优良性状基因的研究和转移。目前用于检测和跟踪长穗偃麦草遗传物质的标记数量十分有限。本研究利用ISSR/IRAP/REMAP技术，筛选获得长穗偃麦草E组染色体特异的DNA片段，然后将其序列转化成特异PCR标记。该标记可以用来检测小麦背景中的长穗偃麦草染色质，也可用于小麦-长穗偃麦草易位系的检测，为小麦育种中外源染色质的快速便捷检测提供新途径。主要结果如下： 1.长穗偃麦草E组染色体特异片段的筛选与分析 利用ISSMRAP/REMAP技术，合成11条引物共35个组合对普通小麦中国春、长穗偃麦草和中国春-长穗偃麦草二体附加系材料进行分析，共筛选出74条分布于长穗偃麦草除2E外的其余6条染色体的特异片段，其中1E、3E、4E、5E、6E、7E分别为7、7、15、19、9、17条。三类引物组合在不同染色体上的特异性丰度有差别，比如2E染色体上未找到特异片段。另外还发现不同引物组合所揭示的小麦背景中E基因组特异性程度具有一定的差异，三类引物组合中，IRAP和ISSR类引物组合扩增的特异片段较少，分别为8和7条，而REMAP类引物组合扩增的特异片段最多，为59条。 2.特异片段的克隆、测序及分析 随机选取了1条5E和5条7E染色体特异的片段进行克隆和测序。测序结果经NCBIGenBank比对结果表明，5E染色体上1条和7E染色体上2条特异的片段去除载体部分后大小分别为445、757和325bp，分别编号为Z2-445、Z21-757和Z12-325。这三个序列除了都含有100bp左右的大麦反转座子BARE-1 LTR DNA序列以外，与小麦基因组无同源序列。由于扩增片段所用引物是依据LTR序列设计，可扩增出100bp左右的LTR序列，实际扩增与理论是相符合的，非同源部分序列则有可能是长穗偃麦草特异的单一序列，推测依据这样的序列设计引物就可扩增出该特异片段，直接通过琼脂糖凝胶电泳观察，方便快捷，从而将其转化为特异PCR标记。 3.长穗偃麦草E组染色体特异PCR标记的发展 分别对Z2-445、Z21-757和Z12-325三条片段设计三对引物，引物组合分别编号为5E-1、P4和ZCP1，理论扩增片段大小分别为304、329和105bp。利用该三对引物分别对普通小麦中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草二体附加系和相应代换系进行了PCR扩增，结果显示扩增片段只出现在长穗偃麦草、中国春.长穗偃麦草相对应的二体附加系及代换系，大小与理论值相一致，表明位于SE染色体(22-445)以及7E染色体(Z21-757、Z12-325)上的3个E染色体特异的片段能够被转换为相对应染色体的特异PCR标记。P4和ZCP1进一步扩增7ES和7EL的端体附加系，又能将Z21-757和Z12-325这两个标记进一步定位到7E染色体臂。结果表明P4、ZCP1两对引物只在7EL端体附加系中扩增出条带，即7E染色体长臂特异的PCR标记。对于转化成功的长穗偃麦草5E和7E染色体特异PCR标记，经多次验证重复性好，扩增稳定，操作便捷，花费低，尤其适合无相关基因组序列信息的情况下需要发展分子标记。可以利用其来鉴定小麦染色体工程育种中的易位系或渐渗系材料中二倍体长穗偃麦草染色质部分，为基因定位克隆提供更多分子标记。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章文献综述

1外源遗传物质向小麦的转移

2小麦背景中外源遗传物质的检测

2.1形态学

2.2细胞学

2.3生化标记

2.4原位杂交

2.5分子标记

3偃麦草属植物在小麦遗传改良中的应用

3.1偃麦草作为小麦育种的优质材料

3.2偃麦草向普通小麦导入的优良基因

3.3偃麦草属特异分子标记研究概况

4长穗偃麦草在小麦遗传改良中的应用

4.1长穗偃麦草基因组研究

4.2长穗偃麦草的研究现状

4.3长穗偃麦草赤霉病抗源及分子标记

5本研究的目的和意义

第二章长穗偃麦草E组染色体特异PCR标记开发

1前言

2材料

2.1小麦

2.2引物

3方法

3.1供试材料基因组DNA的提取

3.2 ISSR、IRAP、REMAP反应体系及程序

3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物

3.4聚丙烯酰胺凝胶条带的割胶回收

3.5琼脂糖凝胶DNA回收

3.6连接反应

3.7感受态大肠杆菌的制备和转化

3.8菌落PCR

3.9质粒PCR

4结果与分析

4.1长穗偃麦草E组染色体特异片段的筛选与分析

4.2 E组染色体特异片段的回收、纯化

4.3 E组染色体特异片段的克隆、测序

4.4长穗偃麦草E组染色体特异PCR标记的发展

4.5 LTR和SSR序列位置效应的验证

第三章长穗偃麦草E组染色体特异分子标记发展和应用讨论

1基于反转座子发展分子标记的可行性

4.2长穗偃麦草E组染色体特异分子标记的建立及应用

4.3长穗偃麦草E组染色体特异PCR标记开发的困难克服

参考文献

附录：各类试剂的配制

致 谢