鸡巨型艾美球虫GAM56基因核酸疫苗的构建及其免疫保护效果

摘要

本研究以GAM56基因为研究对象，构建了鸡球虫核酸疫苗，并通过鸡体试验评价了其免疫原性和免疫保护效果，旨在为其临床用于鸡球虫病的预防控制提供理论依据。 1、巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗的构建及鉴定 以含E.maxima NT株配子体基因cDNA片段的质粒pGEM-T-gam56 DNA为模板，设计一对引物，对GAM56基因含ORF的片段进行PCR扩增，扩增得到与预期大小相符的1465 bp的片段。将扩增的GAM56基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，经EcoRI和HindIII酶切鉴定和阳性重组质粒序列测定证实，GAM56片段正确的阅读框架插入了pCDNA3.1的多克隆位点，基因序列未发生变异。以切胶免疫的鼠源抗GAM56蛋白片段高免血清为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，对转染GAM56基因的COS-1细胞中GAM56基因表达情况进行了IFA检测。转染后72h，在部分COS-1细胞胞浆内和细胞膜上均有GAM56基因的表达，显现较强的荧光信号，证明所构建的核酸疫苗体外在真核细胞中能正确地表达GAM56基因。 2、鸡巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗免疫原性的研究 为了探讨所构建的核酸疫苗是否具有免疫原性，将pcDNA3.1-GAM56质粒分别以100μg、50μg、25μg三个剂量胸肌注射免疫黄羽肉鸡，7日龄首免，14日龄时以相同剂量和途径加强免疫一次，同时设立PBS和空质粒对照组，每组20只鸡。分别于7、14、21、28日龄每组随机抓取5只，无菌心脏采血2 mL，进行血液淋巴细胞转化试验和血清特异性抗体的ELISA检测，分析其细胞免疫和体液免疫水平的变化。结果表明：首免后7d，DNA疫苗各剂量组即能显著增强淋巴细胞的增殖水平(P<0.05)，且以pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组的淋巴细胞增殖水平最高，首免后14和21 d，淋巴细胞增殖水平继续提高。利用间接ELISA法测定抗体水平发现首免后7d各核酸疫苗免疫组均有特异性抗体产生，其中pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组的抗体水平显著高于其他核酸剂量组(P<0.05)，首免后14和21 d，特异性抗体水平继续提高。结果显示，该核酸疫苗具有良好的免疫原性。 3、鸡巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗的免疫保护效果 将pcDNA3.1-GAM56分别以100μg、50μg25μg三个剂量胸肌注射免疫黄羽肉鸡，7日龄首免，14日龄时以相同剂量和途径加强免疫_次，同时设立PBS和空质粒对照组，每组10只鸡。于21日龄时，除未免疫未攻虫组每鸡经嗉囊接种5×104E.maxima NT株孢子化卵囊，7d后称重扑杀。对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率等指标进行统计分析，比较免疫保护效果。结果显示，就增重而言，在三个剂量组中，pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组的相对增重率最高，达89.68％，效果最好；就卵囊产量而言，pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组能有效地减少卵囊产量，卵囊减少率最高，为53.66％。以上结果表明，中剂量pcDNA3.1-GAM56(50μg)核酸疫苗具有良好的免疫保护效果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

文献综述 核酸疫苗及其在寄生虫领域中的应用

1.DNA疫苗的构建

2.DNA疫苗的免疫机制

3.DNA疫苗的免疫途径及剂量

4.DNA疫苗的优化

5.DNA疫苗的优点和缺陷

6.寄生虫DNA疫苗

7.展望

参考文献

第一章巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗的构建及鉴定

1.材料与方法

2.结果

3.小结与讨论

参考文献

第二章鸡巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗免疫原性的研究

1.材料与方法

2.结果

3.小结与讨论

参考文献

第三章鸡巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗的免疫保护效果

1.材料与方法

2.结果

3.小结与讨论

参考文献

全文小结

致 谢