水稻Os-miR396过表达转基因植株的获得及可能功能分析

摘要

microRNA对动植物的正常发育有着非常重要的调节作用。然而，目前植物microRNA的功能研究主要是集中在拟南芥中。本实验以粳稻日本晴为实验材料，试图通过过表达转基因手段研究10个水稻microRNA的功能。这10个水稻microRNA的靶基因分别为F-box蛋白、GRF(Growth regulational factor)以及未知蛋白等等，预期功能分别为影响开花时间、调节茎的长短以及与信号转导和逆境胁迫相关等等。根据靶基因的功能，对这10个microRNA进行探索性研究。取得的主要研究结果如下： 1.根据microRNA前体基因的结构特点，设计引物，成功从水稻基因组利用PCR扩增出了Os-miR396等10个microRNA的前体基因，并将其构建在UbiI水稻组成型启动子之下。 2.以UbiI组成型启动子驱动，将带有目的基因的过表达载体通过冻融法转入农杆菌，再经农杆菌介导来转化水稻愈伤，通过潮霉素筛选得到抗性愈伤组织，经分化再生获得了OS-miR396的T0代转基因植株。 3.经形态学考察，过表达Os-miR396的T0代转基因植株具有明显的矮化性状，其最高高度仅有野生型的一半。在T1代，部分转基因种子晚萌发5-7天，随后的苗期阶段，均呈现出发育迟缓、植株矮化等特点。 4.对转基因植株进行基因组DNA的PCR鉴定，确定含有外源的目的片段。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1 microRNA的发现

1.2 microRNA的代谢和作用机制

1.3 microRNA的生物学功能

1.3.1 microRNA在动物中的功能

1.3.2 microRNA在植物中的功能

1.4本课题研究内容

2材料与方法

2.1材料

2.1.1水稻受体品种

2.1.2农杆菌菌株及质粒

2.1.3酶及试剂

2.1.4所用引物

2.2方法

2.2.1水稻基因组DNA的提取及microRNA前体的PCR扩增

2.2.2 microRNA前体的鉴定和T载体的构建

2.2.3表达载体的构建

2.2.4水稻愈伤组织的诱导和培养

2.2.5农杆菌介导的水稻OsRACK1表达载体的转化和侵染

2.2.6抗性愈伤的筛选、预分化和分化

2.2.7抗性植株的生根和培养

2.2.8转基因水稻植株总DNA的PCR鉴定

2.2.9转基因植株的筛选鉴定及后代的培养

3结果与分析

3.1 10个microRNA前体基因片段的获得

3.2表达载体的构建的结果（以已含获得抗植株的Os-miR396为例）

3.3预测microRNA前体基因经过表达所形成的茎环结构

3.4水稻愈伤的组培结果

3.5表达载体转化农杆菌的结果

3.6农杆菌转化愈伤后的结果

3.7抗性小苗的获得

3.8 T0代转基因植株的表型

3.9抗性植株的PCR分析

3.10 转Os-miR396基因植株的T1代种子及苗期表型

3.11关于Os-miR441过表达的一些分析

4讨论与结论

4.1研究方法上的突破

4.2本研究所取得的成果

4.3其它9个microRNA的预期功能

参考文献

附录

致谢