一株ClassⅠ新城疫病毒的分离鉴定及生物学特性初步研究

摘要

新城疫病毒是世界公认的重要的禽类传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的疫病。近年来，不断有报道在北美、欧洲及香港等地的水禽与活禽市场中分离到多株不同基因型的Class I新城疫病毒，该病毒与目前流行的Class II新城疫病毒在遗传特性和抗原性上差异明显，分子流行病学分析显示其属于两个不同的进化分枝，对于这种Class I新城疫病毒的起源以及在家禽新城疫发生和流行过程中的作用日益得到关注。 本研究对从国内健康鸭中分离到的一株Class I新城疫病毒株的部分生物学特性进行了研究，通过对其全基因组的序列测定，对其遗传学特性进行了研究，通过交叉血凝抑制试验(Cross-HI)对其和经典新城疫病毒在抗原性上的差异进行了研究。结果表明Class I与Class II新城疫病毒在抗原性上存在较大差异，这是国内首次报道该类型新城疫病毒的存在。本课题分为以下3个部分。 1.新城疫病毒ND08-004株的分离鉴定及部分生物学特性研究 从健康鸭中，采用常规的病毒分离培养、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)以及提取RNA进行F蛋白基因的RT-PCR反应，成功分离并鉴定出一株新城疫病毒，命名为ND08-004。通过蚀斑纯化，对其致病指数(MDT和ICPI)进行了测定。结果表明，该毒株不能致死鸡胚，ICPI为0.29，分离株F蛋白裂解位点的组成为112E-Q-Q-E-R-L117，具有典型新城疫弱毒株的分子特征。通过NDV分子流行病学分析显示该分离株在分类地位上属于Class I，与近年来香港活禽市场分离株较为类似，同属于基因3型。 2.新城疫病毒株ND08-004全基因组序列测定 依据GenBank公布的新城疫病毒的基因组序列，自行设计8对特异性引物，运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获取了覆盖ND08-004株全基因组的8个重叠片段。病毒RNA的5’及3’端的序列通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获取。通过对全基因组的拼接和分析显示该分离株基因组长度为15198个核苷酸，基因组长度符合“六碱基法则”，与GenBank中发表的Class II新城疫病毒相比，该毒株在ND08-004株的P基因495nt～496nt位多出12个核苷酸，ZJ1、SR203、SF02等毒株(15192bp)在NP基因非编码区，全基因组1647～1648nt比ND08-004株多6个核苷酸。 ND08-004与7株Class II NDV毒株V4、B1、LaSota、Mukteswa、Herts/33、ZJ-1、SF02在0～55nt位的Leader序列的同源性在85.5％～89.1％之间，与DE-R49/99株在该段基因序列的同源性为94.5％，7株Class II NDV毒株的该片段基因序列的同源性在85.5％～98.2％之间。ND08-004与V4、B1、LaSota、Mukteswa、Herts/33在15073～15186nt位的Trailer序列的同源性在57.9％～58.8％之间，与ZJ-1、SF02在15079～15192nt位的Trailer序列的同源性均为24.6％，与DE-R49/99在该段基因序列的同源性为88.6％。 3.ND08-004株和经典新城疫毒株抗原性的比较 分别以弱毒疫苗Lasota株、基因VII型代表株宁夏分离株、ND08-004株和F48E8株为灭活疫苗制备相应的抗血清。将四株病毒分别与相应的抗血清做交叉血凝抑制试验(Cross-HI)，以次来比较不同来源病毒间的抗原同源性关系。在交叉HI中，ND08-004株与LaSota株的抗原性的同源性为71.42％，ND08-004株与宁夏株的抗原性的同源性为57.14％，ND08-004株与F48E8株的抗原性的同源性为66.82％，表明ND08-004株与Class II新城疫病毒在抗原性上存在很大差异。 本研究为深入了解新城疫病毒的演化规律奠定了基础。

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文献综述

一、NDV概述

1.新城疫病毒的分子生物学特性

二、新城疫病毒的演化以及流行病学研究概况

1.NDV宿主范围的演化

2.NDV毒力的演化

3.NDV流行病学研究概况

4.ClassⅠ新城疫病毒的研究进展

研究一、一株ClassⅠ新城疫病毒的分离、鉴定及部分生物学特性研究

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1病毒分离

2.2病毒蚀斑纯化

2.3分离株生物学特性鉴定

2.4分离株毒力测定

2.5 RT-PCR鉴定

3.讨论

研究二、新城疫病毒ND08-004株全基因组序列测定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 ND0004株全基因组主要序列扩增

2.2病毒基因组末端cDNA的获取(RACE)

2.3全基因组序列分析

3.讨论

研究三、ND08-004株和经典新城疫毒株抗原性的比较

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 HI交叉抑制结果

3.讨论

参考文献

附录

致谢