睾丸内注射转染EGFP基因及其在精子中表达的研究

摘要

背景和目的：目前实验室制备转基因动物常用方法仍然是原核显微注射法。但该方法需要使用昂贵的显微注射仪，技术要求较高，外源基因整合率低，整合有较大的随机性。此外，犬等动物卵母细胞或受精卵胞浆中富含脂质，在显微镜下不易看到原核，使此技术在一定程度上受到了限制。因此，为了制备转基因犬，我们以雄性动物为对象，运用雄性配子的生精与遗传原理，采用睾丸内直接注射法，制备通过精原干细胞介导的转基因动物。利用精原干细胞介导的转基因技术是转基因动物制作的一条崭新途径，特别是对那些人工难以调控繁殖活动动物的转基因研究具有十分重要的意义。 方法：通过探讨不同年龄、不同注射方法和不同注射量对转染后小鼠的生殖能力的影响，挑选合适年龄小鼠用于转基因研究。通过冰冻切片和PCR检测，观察小鼠EGFP基因整合情况。 在对小鼠睾丸内注射法优化的基础上，我们以毕格犬为实验对象，探讨了不同量的DNA转染后对精液品质、睾丸组织的影响，以及转染后在睾丸组织和精子中的表达情况，以筛选出最合适的注射剂量。研究睾丸内直接注射法的可行性，优化睾丸内注射法。 结果：通过对5周龄和7周龄小鼠注射EGFP基因，发现注射后，7周龄小鼠的存活率和平均产仔数优于5周龄小鼠。提示7周龄的小鼠为实验的最佳年龄。我们将实验小鼠的一侧输精管结扎不注射外源基因，仅注射未结扎一侧睾丸，发现结扎、单侧睾丸注射小鼠的生殖能力优于不结扎的双侧注射小鼠。研究采用40μl和60μl基因转染液注射小鼠睾丸，发现60μl的转染液，使睾丸内的压力变得很大，转染液从注射孔中流出，也对睾丸造成一定程度的损伤，使它的存活率、配种率和平均产仔数均低于40μl剂量组。取18只小鼠在注射后20天，每隔5天取睾丸组织，每次取三个样，共取6次。通过荧光显微镜对冰冻切片观察发现实验鼠的睾丸中精原干细胞有EGFP基因表达。 选取10只性欲旺盛的2-3岁的毕格公犬，分成5组，每组两只(一只用于精液采集，另一只用于冰冻切片的制作)，一侧结扎，分别对未结扎侧注射200μg、300μg.400μg、500μg、600μg五种不同剂量的DNA(一次)，每隔四天注射一次，共注射三次。经50，60，70，80天收集精液，进行精液品质评价。结果显示200μg、300μg处理剂量组，犬的精液品质与处理前相比没有明显变化。而400μg、500μg、600μg处理剂量组，特别是500μg、600μg处理剂量组犬的平均精液射精量、密度、活力和外观色泽与处理前相比，下降比较明显。对收集的精液荧光显微镜下观察发现，在注射400μg剂量质粒的犬(W219)，在注射后60-70天时收集的鲜精有微弱的EGFP表达，其余样本均未见EGFP表达。睾丸内注射30天后，每组剂量各取一只犬的睾丸制作冰冻切片，和未注射的正常犬的睾丸比较，结果显示500μg、600μg剂量，对犬睾丸组织有一定的损伤，曲细精管呈散在状。通过荧光显微镜检查发现，400μg剂量组睾丸中精原干细胞有EGFP基因表达，综上所述，得出400μg剂量是犬睾丸内注射的最适剂量。 结论：本研究针对可能影响犬和小鼠睾丸内注射介导EGFP基因转移中的主要因素，探讨了睾丸内注射法介导基因转移的可行性，优化了睾丸内注射法。得到了表达EGFP基因的小鼠精原干细胞和表达EGFP基因的犬的精原干细胞和精子。虽然转染阳性率比较低，但是这一结果初步证明了这一方法的可行性。待方法进一步优化后，有望获得大量的转染EGFP基因的精原干细胞和精子，通过体外移植或者胞浆单精显微注射技术获得转基因动物。本实验的研究结果，使我们在制备转基因犬的探索道路上前进了一大步。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分文献综述 以雄性动物为对象制备转基因动物研究进展

1转基因动物制备的主要方法

2生精细胞法介导基因转移研究进展

3报告基因--增强型绿色荧光蛋白

4本研究的目的与意义

参考文献

第二部分研究论文

第一章小鼠睾丸内注射法介导EGFP基因转染

1引言

2材料

3试验方法

4结果

5讨论

第二章犬睾丸内注射法介导EGFP基因转染

1引言

2材料

3试验方法

4结果

5讨论

全文小结

参考文献

致谢

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