伊维菌素抗独特型和抗异型抗体的制备及鉴定

摘要

伊维菌素属于大环内脂类抗生素，由于其具有优良的驱虫特性而广泛应用于畜牧养殖中。虽然伊维菌素的作用剂量较小，但是作为脂溶性药物，它在动物体内的残效时间较长，因此WHO将其列为高毒化合物，所以伊维菌素药物在动物组织中残留不容忽视。
　　 目前较常用的检测IVM的方法主要有色谱技术，如：高效液相色谱检测法(HPLC)、气相色谱(GS)；免疫学分析方法，如：酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫测定法(CGIA)等。但是色谱技术存在着方法复杂、耗时长、花费大、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选等问题，而免疫学检测方法可以解决这些问题，其中的ELISA法就是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大样品的快速筛选。
　　 常规的ELISA方法对IVM检测主要依赖于竞争ELISA法，尽管非竞争ELISA法相对于竞争法有更高的检测灵敏度，但是由于IVM分子量太小，阻碍其与两种抗体同时结合，所以这类检测方法不适合半抗原的测定。近年来，为解决这个问题，人们做了很多尝试，其中抗独特型和抗异型抗体为非竞争法应用于半抗原检测上提供了支持。
　　 为获取针对伊维菌素(IVM)的抗独特型抗体或抗异型抗体，制备针对IVM的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，经纯化获得IVM兔多抗血清纯化抗体(PAb1)和鼠单抗腹水纯化抗体(MAb1)，将PAb1、MAb1分别加入含10μg/mL IVM的20％甲醇-PBS中，4℃反应24h，制备两种抗原抗体复合物，做为免疫原，分别免疫BALB/c小鼠，经对比发现，以PAb1与IVM反应制备的复合物为免疫原的免疫效果较好。选取适宜小鼠融合，通过对杂交瘤细胞的筛选，获得3株能稳定分泌抗IVM独特型抗体(Ab2)的细胞株，命名为Ab2-1、Ab2-2、Ab2-3。
　　 研究了Ab2的性质，结果表明，Ab2仅与针对IVM的抗体反应，且亲和性良好(K=5.04×1010L/mo1)，与其它抗体交叉反应率较小，其具有很好的特异性。以IVM-OVA为包被原，MAb1为反应抗体，Ab2为竞争抗原，IC50=33.771μg/mL;以Ab2为包被原，MAb1为反应抗体，IVM为竞争抗原，IC50=0.4μg/mL，另外还得出线性良好的Ab2与IVM对应关系曲线y=1.9076X-6.4507，以上都表明了Ab2和IVM有很好的内影像关系，验证了Ab2属β独特型抗体。为建立小分子半抗原检测的竞争ELISA以Ab2β取代作为标准品的强毒性半抗原(如黄曲霉毒素、河豚毒素、吗啡等)，以及以抗独特型抗体建立小分子半抗原双位点法(非竞争)免疫检测打下了一定基础。本实验没有获得有效的IVM抗异型抗体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分前言

1伊维菌素及其残留的免疫学检测

1.1伊维菌素的理化性质

1.2伊维菌素残留免疫学检测

2抗独特型抗体和抗异型抗体

2.1抗独特型抗体

2.2抗异型抗体

3本研究的目的、意义及思路、技术路线

第二部分伊维菌素抗体的制备及鉴定

1材料和方法

1.1实验动物与生物材料

1.2主要试剂

1.3实验仪器

1.4主要溶液系统

1.5伊维菌素抗体的制备及鉴定

1.6抗体蛋白浓度的测定

1.7 ELISA检测抗体方法的建立

1.8抗体效价及抑制测定

1.9抗体特异性鉴定

1.10抗体亲和力的测定

1.11伊维菌素抗体的纯化及鉴定

2结果和分析

2.1抗体蛋白质浓度

2.2抗体效价及抑制

2.3抗体特异性鉴定

2.4抗体亲和力的测定

2.5伊维菌素抗体的纯化及鉴定

3讨论

第三部分伊维菌素抗独特型或抗异型抗体的制备

1材料方法

1.1实验动物与生物材料

1.2主要试剂

1.3仪器和器材

1.4主要溶液系统

1.5伊维菌素抗异型和抗独特型抗体的制备

1.6抗独特型抗体特性的纯化及特性鉴定

2结果和分析

2.1摸索抗血清与药物反应的最适条件

2.2不同浓缩条件对抗原抗体复合物的影响

2.3封闭条件的摸索

2.4免疫后小鼠效价的测定

2.5细胞融合及筛选鉴定

2.6抗独特型抗体特性的鉴定

3讨论

全文结论

参考文献

致 谢