芸薹属种间关系及其人工合成甘蓝型油菜早期世代蛋白质组学的研究

摘要

芸薹属(Brassica)是十字花科(Cruciferae)植物中最为重要的一属，具有重要的经济价值。本研究采用细胞遗传学、分子生物学以及蛋白质组学等方法，对芸薹属中的A和C基本种及人工合成甘蓝型油菜形成过程中蛋白质组的变化规律进行研究，从而为异源四倍体物种的形成及其表观遗传学的研究提供重要的理论依据。主要研究结果如下：
　　 1.基本种45S rDNA重复序列的有丝分裂与减数分裂的FISH定位分析
　　 利用荧光原位杂交(FISH)技术，以标记的45S rDNA重复序列作探针，研究了芸薹属3个基本种Brassica rapa，B.oleracea与B.nigra的根尖体细胞中期染色体杂交信号的分布特点、花粉母细胞减数分裂粗线期染色体的空间分布、终变期染色体的配对构型等。研究结果表明B.rapa的10条(5对)染色体上表现明显而强烈的杂交信号，且分布在着丝粒和亚着丝粒区域；B.nigra的6条(3对)染色体上有杂交信号，主要分布在染色体短臂的近末端处，减数分裂后期Ⅰ中，3个信号平均分配到细胞两极；B.oleracea中的4个45S rDNA杂交位点与B.nigra中类似，都位于染色体短臂的近末端处。其中B.rapa与B.nigra的45S rDNA的花粉母细胞的减数分裂FISH定位是首次报道。该结果旨在为研究A、B、C基因组间的亲缘关系和进化提供细胞学依据。
　　 2.着丝粒重复序列FISH及CAPS分析芸薹属A、B和C基因组间的关系
　　 以来源于B.rapa基因组(AA)的重复序列(151bp)为探针，分别同二倍体白菜型油菜、甘蓝和异源四倍体芥菜型油菜(AABB，2n=36)的中期染色体杂交，白菜型油菜和甘蓝的所有染色体上都有杂交信号，芥菜型油菜的染色体上显示出20个明显的信号，其余染色体上信号弱或无，可以区分出A与B基因组。对来源于油菜3个基本种与3个复合种FAE1基因进行CAPS分析表明，3个基本种表现出不同的酶切式样，用MboI和MspI酶切表现出多态性，基因组A和C非常相似，而基因组B与A、C关系较远，同时3个复合种也并不是2个基本种的简单相加，表明异源四倍体在进化过程中可能发生了重排和重组。
　　 3.基本种与复合种间种子贮藏蛋白质亚基构成及聚类分析
　　 根据种子贮藏蛋白形成的蛋白质谱带具有的稳定性、均匀性和可加性的特点，对组成芸薹属3个基本种和3个复合种的种子贮藏蛋白亚基的组成进行了SDS-PAGE比较分析，结果表明：不同种间的种子贮藏蛋白具有一定的差异，表现出丰富的多态性；6个种共有24条亚基带，并各自具有特有的蛋白谱带。利用贮藏蛋白亚基条带的信息，分析了种间的蛋白相似度，并进行了聚类分析，将供试材料分为两类。Ⅰ类为白菜型油菜、甘蓝与甘蓝型油菜。Ⅱ类为为黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥。
　　 4.芸薹属A、C基因组间比较蛋白质组学的分析及PCR分子标记的开发
　　 白菜和甘蓝亲缘关系非常接近。运用蛋白质组学方法比较了芸薹属二倍体种白菜型油菜(AA)和甘蓝(CC)幼苗期叶片蛋白质组学的变化，通过比较研究，以期探寻它们在蛋白组水平上基因表达特征。应用双向电泳对叶片总蛋白进行了分离，从2-D凝胶上各检测到95与111个蛋白点，应用PDQuest软件对凝胶图谱进行分析，二者间匹配到的蛋白质点数为29，占总数的28.2％，其中芸薹与甘蓝的的专化蛋白分别66和82个，分别占蛋白点总数的32.0％与39.8％。MALDI-TOF-MS质谱分析和数据库检索鉴定了其中的20个差异表达蛋白，但可靠差异蛋白的鉴定率仅为50％。该研究首次基于两个物种的特征(差异)蛋白，开发出10个用于区分A和C基因组的基于PCR的分子标记。
　　 5.利用差异蛋白质组对人工合成甘蓝型油菜F1及早期世代蛋白质变化的研究
　　 多倍化是高等植物进化过程的重要阶段，是植物进化的主要动力之一。研究表明，异源多倍体在形成的早期会出现广泛的基因组遗传和表观遗传变化，这些变化直接关系到物种的形成和稳定。人工合成的异源多倍体则为这方面的研究提供了良好的模式系统。通过这种模式系统，可以精确比较亲本二倍体种与人工异源多倍体早期世代间的基因组变化特点，从而为丰富多倍体物种进化理论提供重要的理论依据。本研究基于人工合成的异源四倍体甘蓝型油菜及其不同自交后代，比较研究杂种F1与双亲间、以及早期1～4代间的的叶片蛋白质组变化，探索种间杂交及其多倍体形成后引发的遗传和表观遗传变化的规律。具体结果如下：
　　 (1)人工合成甘蓝型油菜F1及其亲本叶片比较蛋白质组学研究
　　 以芸薹属二倍体B.rapa(AA，2n=20)和B.oleracea(CC，2n=18)和人工合成甘蓝型油菜为实验材料，由于双亲及后代遗传背景清晰，为研究异源多倍体早期基因组在进化过程中的具体变化提供了良好的实验材料。结合蛋白质组学方法来解析新合成的B.napusF1代与其双亲叶片蛋白质组表达差异，鉴定了一些有价值的蛋白点。首先是亲本间的差异蛋白质几乎都在B.napus中表达，但显著偏离双亲丰度表达均值，表现为非加性表达效应。此外经MALDI-TOF-MS鉴定了杂种中7个有显著性意义的蛋白，其中1个与光合作用相关，推定为景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶；2种与能量代谢相关的ATP合酶β-亚基；1个与物质代谢相关ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基；1个与转录相关的RNA聚合酶β-链；另1个与抗病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与1个假定蛋白。这些蛋白与具有杂合子潜力的杂种优势相关，为了解杂种优势在蛋白质组水平上的基因表达基础积累了重要的资料，是前人在转录水平上研究的必要补充，从而为进一步阐明杂种优势的机制提供理论依据。此外实验还表明B.napus在多倍化后可能发生了基因重组，并且新蛋白的功能可能会影响F1杂种的表型性状。
　　 (2)人工合成甘蓝型油菜早期世代蛋白质组的变化
　　 我们对人工合成甘蓝型油菜1～4代叶片蛋白质进行了比较分析发现，在后代中发生了非孟德尔式的表观遗传变异，变异主要表现为基因沉默的方式。依据蛋白表达变化特点将F1～F4的差异蛋白质归为五类：1)F2专化类型；2)F3专化类型；3)F1中丢失的蛋白，而F2～F4中表达的类型；4)F1～F2丢失，而F3～F4中表达的类型；5)F1～F4中蛋白丰度逐渐上调的类型。表明丢失的蛋白可能并不是真正的丢失，而可能是发生了基因沉默，而且基因沉默随时可能被激活。在已鉴定的蛋白中，有与物质与能量代谢、信号转导、解毒酶类、蛋白质降解、反转座子相关以及功能未知的假定蛋白。统计后分析尽管基因组早1～4代中发生了随机表观遗传变异，但保证细胞正常基因功能的持家蛋白并没有随基因表达的变化而完全消失，也间接证明了早期多倍化事件中的基因组冲击未必带来蛋白质组上的冲击。相反会有一个新的快速的协调顺序进化在新合成的异源甘蓝型油菜中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略语说明

声明

第一章文献综述

1芸薹属基因组研究进展

1.1芸薹属植物基因组间亲缘关系

1.2芸薹属A、B和C基因组之间的关系

1.3芸薹属基因组结构和起源进化研究

2分子原位杂交技术及其发展

2.1 DNA分子杂交技术的概念

2.2原位杂交技术的发展

2.3 FISH在物理作图中的应用

3核糖体基因在芸薹属中的研究应用

3.1核rDNA序列的同步进化

3.2植物核rDNA-FISH在芸薹属中的物理定位

4甘蓝型油菜人工合成种的研究

4.1甘蓝型油菜的起源与进化

4.2人工合成甘蓝型油菜的研究

4.3研究甘蓝型油菜人工合成种的目的与意义

5植物异源多倍体形成过程中的基因组变异和表观遗传变异

5.1亲本序列消除

5.2表观遗传变异

6蛋白质组学的研究

6.1蛋白质组学的历史背景

6.2植物蛋白质组学研究概况

6.3蛋白质组学研究必要性与意义

参考文献

第二章芸薹属基本种45SrDNA重复序列的有丝分裂与减数分裂的FISH定位分析

前言

1材料与方法

1.1植物材料

1.2染色体制片

1.3探针的标记

1.4原位杂交

1.5信号检测和图像处理

2结果与分析

3讨论

参考文献

第三章着丝粒重复序列原位杂交及CAPS标记分析芸薹属A、B和C基因组间的关系

前言

1材料和方法

1.1植物材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1原位杂交分析

2.2 FAE1基因的克隆和CAPS分析

3讨论

4结论

参考文献

第四章芸薹属种子贮藏蛋白质组分的比较研究

前言

1材料与方法

1.6植物材料

1.2方法

2结果与分析

2.1油菜种子贮藏蛋白质亚基分析

2.2 6个种蛋白质亚基相似度及亲缘关系

2.3种间的遗传距离和聚类分析

参考文献

第五章芸薹属A、C基因组间比较蛋白质组学的分析及PCR分子标记的开发

前言

1材料与方法

1.1材料

1.2仪器与试剂

2实验方法

2.1油菜叶片可溶性蛋白2-DE样品的提取与溶解

2.2采用Bradford法测定样品溶液中蛋白质含量

2.3双向凝胶电泳

2.4根据差异蛋白的核酸序列合成引物进行PCR反应

3结果与分析

3.1 PDQuest软件分析油菜二倍体芸薹与甘蓝叶片可溶性蛋白的差异

3.2差异表达蛋白的MALDI-TOF-MS分析及数据库检索

3.3 PCR鉴定

3.4讨论与结论

参考文献

第六章利用差异蛋白质组对人工合成甘蓝型油菜F1及早期世代蛋白质变化的研究

第一节人工合成甘蓝型油菜F1及其亲本叶片比较蛋白质组学研究

1材料与方法

2实验方法

3结果与分析

第二节人工合成甘蓝型油菜早期世代蛋白质组的变化

1材料与方法

2实验方法

3结果与分析

4人工合成甘蓝型油菜后代表观遗传变化的分析

参考文献

致谢

博士期间发表的论文