人工合成甘蓝型油菜不同世代中转座子甲基化变化规律的研究

摘要

多倍体化是自然界中普遍存在的现象，在植物的进化历程中起着重要的作用，但是目前人们对多倍体产生及其进化的机制还没有彻底的研究清楚。甘蓝型油菜是由芸薹属的白菜和甘蓝在自然条件下通过异源杂交后加倍得到的多倍体，是多倍体化的典型研究对象之一。人工合成甘蓝型油菜不仅可以用来拓宽甘蓝型油菜的遗传多样性，为油菜育种提供新种质资源，还可以通过人工重现异源杂交过程，来研究异源多倍体进化过程中的具体变化。人工合成甘蓝型油菜在形成过程中会发生大量的基因组结构和基因表达水平的变化，同时还伴随着大量表观遗传学的改变。有研究结果显示出转座子在异源多倍体化中的结构重建和表观遗传学调节机制中可能起着中心作用，但对其具体作用和调节机制了解并不多。DNA甲基化作为较早发现的表观遗传学现象之一，在其中起着主要和重要的作用，转座子的活性与其甲基化的程度有着密切联系。
　　目前，对于人工合成甘蓝型油菜创建和自交过程中跨世代的转座子甲基化模式变化规律相关研究很少。为了了解在异源多倍体化早期阶段中转座子甲基化模式的变化规律，探索转座子在异源四倍体油菜形成过程中可能的作用机制，本试验对人工合成甘蓝型油菜(S0)及其3个自交世代(S1、S2、S3)以及亲本白菜(P1)和甘蓝(P2)的幼叶和花蕾混合样的转座子侧冀CCGG位点的胞嘧啶甲基化进行了甲基化敏感多态性扩增(MSAP)检测，得到的主要研究结果如下:
　　(1)本试验共选用了16对选择性扩增引物组合（转座子特异性引物分别与HpaⅡ/MspⅠ的接头引物HM-primer组合）对羽衣甘蓝与白菜型油菜杂交得到的人工合成甘蓝型油菜S0到S3代以及亲本共计36个样本材料进行了转座子侧冀序列CCGG位点的甲基化状态进行检测。其中，反转录转座子引物共9对，包括LTR转座子引物6对，LINE转座子引物1对，SINE转座子引物2对。DNA转座子引物7对，包括Harbinger转座子引物1对、hAT转座子引物2对、Tcl-Mariner转座子引物1对和PiggyBac转座子引物1对，以及着丝粒区域转座子引物2对。36份样本材料共检测出221个位点（条带），其中清晰可记录的有136个位点，平均每对引物检测到8.5个位点，反转录转座子引物对检测到的位点有76个，DNA转座子引物检测到的位点有60个。
　　(2)从二倍体亲本到异源四倍体人工合成甘蓝型油菜S0，转座子附近CCGG位点发生了广泛的甲基化变化。LTR、LINE、SINE、Harbinger、hAT、Tc l-Mariner、PiggyBac和Centromere region transposons侧冀CCGG位点甲基化变化率分别为36.54％、37.50％、43.75％、62.50％、43.75％、37.50％、100％和27.78％。甲基化状态变化类型既有去甲基化，又有超甲基化;LTR、LINE、SINE、Harbinger、hAT、Tcl-Mariner和Centromere regiontransposons以超甲基化为主，PiggyBac以去甲基化为主。检测到P1亲本特异位点去甲基化（LTR、hAT、PiggyBac和Centromere region transposons），没有检测到P2亲本特异位点去甲基化和P1亲本与P2亲本位点同时去甲基化。超甲基化既可发生在P1亲本特异位点(LTR、LINE、SINE、Harbinger、hAT、PiggyBac和Centromere region transposons)又可发生在P2亲本特异位点（LTR、Harbinger、hAT和PiggyBac），还有P1亲本与P2亲本位点同时超甲基化。
　　(3)人工合成甘蓝型油菜S0自交后代同一世代的不同株系间各类转座子旁侧CCGG位点的甲基化状态存在很大差异。事实上，考虑所有检测的位点，在4个世代中没有哪2个或更多的株系其转座子甲基化模式是相同的。
　　(4)与S0相比，S1、S2和S3中都有相当比例的转座子旁侧CCGG位点发生了甲基化状态的改变;在S3代，除LINE和SINE外，其它转座子在所有检测的位点都可发生甲基化状态的改变。从S1到S2再到S3，LTR、LINE、SINE和PiggyBac转座子甲基化变化比例表现为先降后升，Harbinger、hAT、Tc l-Mariner和Centromere region转座子甲基化变化比例表现为持续上升。对S0、S1、S2和S3代4个世代之间转座子侧冀CCGG序列甲基化状态稳定的位点进行分析，LTR、SINE、Harbinger、hAT、Tc1-Mariner、和Centromere regiontransposons在前3个世代都有少量甲基化状态稳定的位点，但在S3这些位点都发生了甲基化状态的变化，在4个世代中没有转座子甲基化状态保持稳定的位点;LINE转座子的8个位点中，有2个位点在4个世代中甲基化状态保持稳定，占25％，在4个世代中，没有任何世代间PiggyBac甲基化状态保持稳定的位点。
　　(5)在人工合成甘蓝型油菜S0及其自交后代中，各类转座子的甲基化水平在世代间呈一定规律性变化。从S0到S1到S2再到S3，反转座子LTR、LINE和SINE的非甲基化水平都表现降-升-升的特点;DNA转座子hAT、 PiggyBac和Centromere region transposons的非甲基化水平都表现降-升-降的特点;DNA转座子Harbinger和Tcl-Mariner非甲基化水平都表现升-升-降的特点。
　　(6)与人工合成甘蓝型油菜S0相比，其自交的前3个不同世代中，转座子侧冀CCGG序列位点既有去甲基化又有超甲基化的变化，有先超甲基化为主再去甲基化为主的趋势。
　　以上结果表明，在以白菜和甘蓝人工合成甘蓝型油菜以及人工合成甘蓝型油菜自交不同世代中，转座子甲基化模式发生了很大的变化，既有去甲基化又有超甲基化，在合成当代(S0)和自交S1代，甲基化模式变化主要以超甲基化为主，随后则以去甲基化为主。这种转座子附近序列甲基化模式变化可能会改变转座子活性，从而会对基因组结构和基因的表达甚至植物的表型产生影响。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 转座子概述

1．1．1 转座子的发现与研究历程

1．1．2 转座子的分类

1．1．3 转座子的转座机制

1．2 转座子与植物基因组和基因进化

1．2．1 转座子与基因组进化

1．2．2 转座子与基因调节

1．3 转座子的活性及其甲基化

1．4 异源多倍体化对基因组和表观遗传的影晌

1．4．1 异源多倍体的基因组结构变异

1．4．2 异源多倍体的表观遗传变异与DNA甲基化

1．5 异源多倍体化对转座子的影响

1．5．1 异源多倍体化对转座子的转录激活

1．5．2 异源多倍体中转座子的甲基化变化

1．6 人工合成甘蓝型油菜形成初期的遗传变异

2 引言

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．2 主要实验试剂配制及实验仪器

3．2．1 DNA提取试剂

3．2．2 电泳试剂配制

3．2．3 银染试剂配制

3．2．4 主要仪器设备

3．3 技术路线

3．4 实验方法

3．4．1 植物基因组DNA的提取与纯化

3．4．2 引物设计

3．4．3 甲基化敏感多态性扩增

3．4．4 MSAP产物的电泳检测

3．4．5 分子标记数据统计

4 结果与分析

4．1 基因组DNA的提取与纯化

4．2 MSAP检测

4．2．1 双酶切

4．2．2 连接与预扩PCR

4．2．3 选择性扩增PCR

4．2．4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

4．3 亲本到人工合成甘蓝型油菜S0代转座子侧冀CCGG序列甲基化状态变化特点

4．3．1 LTR转座子

4．3．2 LINE转座子

4．3．3 SINE转座子

4．3．4 Harbinger转座子

4．3．5 hAT转座子

4．3．6 Tcl-Mariner转座子

4．3．7 PiggyBac转座子

4．3．8 着丝粒区域转座子

4．4 人工合成甘蓝型油菜自交后代转座子侧冀CCGG序列的甲基化变化

4．4．1 同一世代株系间转座子甲基化模式的差异

4．4．2 世代间转座子甲基化状态变化位点的比例

4．4．3 不同世代间转座子甲基化水平比较

4．4．4 世代间甲基化状态的变化特点

5 讨论

5．1 转座子甲基化在异源多倍体进化中的重要作用

5．2 不同类型转座子的甲基化模式变化的差异

5．3 白菜和甘蓝基因组结构与种间杂交过程中转座子甲基化模式变化的关系

参考文献

致谢

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