新型PR1-HLA-A0201-SCT四聚体的制备及初步鉴定

摘要

MHCⅠ四聚体(major histocompatibility complexⅠtetramer)可以对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)进行检测和筛选，是了解机体细胞免疫功能、探索疾病机理和评价特异性免疫疗法的重要工具之一。由于具有敏感、特异、高效、对细胞无损伤等优点，MHCⅠ tetramer技术一诞生就成为CTLs定量检测的金标准。但是传统MHCⅠ四聚体制备流程繁琐，蛋白复性时需要MHCⅠ及β2-microglobulin(β2m)两条肽链及抗原肽同时正确折叠，复性效率很低，对抗原肽的亲和力要求也高，亲和力低的抗原肽很难形成稳定的四聚体。由于存在上述不足，限制了MHCⅠtetramer技术的大规模应用，许多学者都试图对该技术进行改进。
　　 单链三聚体(single chain trimer,SCT)是将抗原肽、β2m和MHCⅠ分子以适当的接头(linker)依次串联而成，是对传统四聚体技术的重大改进，更有利于抗原特异性CTLs的检测。
　　 慢性髓细胞样白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病。PR1为来自CML相关抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽(VLQELNVTV)，其诱导的CTLs可杀伤白血病细胞，但对正常骨髓细胞无毒性。本研究的目的是制备HLA-A*0201限制性的PR1-HLA-A*0201-SCT(以下简称PR1-SCT)四聚体，以联合流式细胞技术对PR1特异性CTLs进行研究，为CML的过继细胞免疫治疗奠定基础。
　　 本研究中，我们首先利用基因工程技术将PR1肽、β2m及HLA-A*0201以(G4S)n柔性linker依次串联，构建PR1-SCT融合基因，再克隆至pQE31载体中进行原核表达，通过洗涤包涵体获得大量PR1-SCT包涵体蛋白。
　　 接着我们利用pQE31载体中的6×His tag对PR1-SCT包涵体蛋白进行纯化，通过稀释复性使其恢复天然构象。通过在复性体系中引入2 mol/L尿素，大大提高了复性效率。
　　 我们进一步对复性的PR1-SCT蛋白进行生物素化，并根据生物素化效率，与PE标记的链霉亲和素按适当比率混合，制成新型PR1-SCT四聚体，并对其进行了初步鉴定，期望能为CML的临床和基础研究提供有力工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前 言

第一部分构建pQE31-PR1-HLA-A*0201-SCT原核表达载体

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二部分PR1-HLA-A*0201-SCT融合蛋白的表达、纯化及复性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分新型PR1-HLA-A*0201-SCT四聚体的制备及初步鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四部分讨论与结语

1 讨论

2 结语

文献综述 单链三聚体技术简介

附 件

致 谢