弯曲菌耐药性与耐药基因检测分析及其基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的分型研究

摘要

弯曲菌是世界范围内造成人类细菌性腹泻的重要致病菌之一，其中最常见的是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌感染。无论是在发展中国家还是在发达国家，弯曲菌的感染率都呈上升趋势；更为严重的是，感染率的上升造成耐药弯曲菌的迅速出现。同时有研究证明，临床使用抗生素尤其是喹诺酮类抗生素是加快弯曲菌耐药性出现的主要原因。
　　 通常来说，抗生素药敏实验标准操作方法对大多数的微生物都是适用的，其中被广泛接受并应用的是CLSI(临床实验室标准化协会)提供的指导方针。但是由于弯曲菌是微需氧菌，在微氧条件下才能生长，对其的抗生素药敏试验没有一个可用的实验操作标准，也没有明确的耐药突破点判定标准。因此，在临床、微生物实验室的检测中出现了许多不同的方法，例如：纸片扩散法和微量肉汤稀释法。
　　 本研究的目的是(1)比较纸片扩散法和微量肉汤稀释法，确定纸片扩散法能否成为弯曲菌药敏试验的可靠的备选方法(2)分析耐药基因在空肠弯曲菌和结肠弯曲菌中的分布，为弯曲菌的分子流行病学监测、研发新型抗菌药物及指导临床正确使用抗生素提供科学依据。(3)利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对弯曲菌进行检测分型。
　　 本研究应用纸片扩散法和微量肉汤稀释法分别测定了203株空肠弯曲菌和19株结肠弯曲菌对11中抗生素的耐药情况。根据微量肉汤稀释法，203株弯曲菌对11种抗生素的耐药率分别为：红霉素(2.46％)，链霉素(11.82％)，环丙沙星(91.13％)，阿莫西林(14.78％)，克林霉素(4.93％))，头孢噻肟(5.91％)，四环素(84.73％)，左氧氟沙星(83.74％)，诺氟沙星(88.67％)，恩诺沙星(88.67％)，萘啶酸(88.18％)。比较纸片扩散法和微量肉汤稀释法的结果，两种方法测定环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、萘啶酸和链霉素耐药情况结果具有较高的一致性，其它几种抗生素符合率相对较低。根据统计分析结果，我们有以下的建议：红霉素的敏感的突破点由≤0.5μg/mL改为≤1μg/mL；四环素的敏感突破点由≤4μg/mL改为2μg/mL；克林霉素耐药的抑菌圈直径由≤18mm改为≤14mm；阿莫西林的敏感突破点由≤8μg/mL改为≤4μg/mL，同时耐药突破点有≥32μg/mL改为≥64μg/mL，这样将明显提高两种方法的符合率。
　　 对弯曲菌耐药基因的检测结果显示，6株链霉素耐药的分离株携带aadA基因，占总数的2.96％，12株链霉素耐药的弯曲菌携带aadE，占总数的5.91％。84.73％的分离株携带tetO gene，这些分离株四环素高度耐药。对红霉素耐药的弯曲菌基因片段序列分析结果表明，红霉素耐药弯曲菌23S rRNA基因上存在一个A2075G的点突变。然而，对23株喹诺酮类耐药的弯曲菌gyrA基因序列分析结果显示，没有出现典型的C257T突变。利用半定量RT-PCR检测23株喹诺酮耐药弯曲菌cmeB基因的表达情况。结果显示，16株弯曲菌cmeB过量表达。这一结果表明cmeB基因的过表达与弯曲菌对喹诺酮类抗生素耐药有关。
　　 为研究弯曲菌菌株间的关系，建立了MALDI-TOF MS分型方法，对9株分离株进行了分型研究，经相同条件培养后，应用MALDI-TOF MS进行检测。结果表明弯曲菌质谱图在质荷比2000-9551的范围内，鉴定结果显示8株弯曲菌与数据库中编号为MB519505THL的弯曲菌高度同源，NCTC11168与编号为MB724005 THL的弯曲菌高度同源。MALDI-TOF MS在弯曲菌分型中具有一定的分型能力，可成为弯曲菌分析鉴定的重要工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章 弯曲菌耐药现状和耐药机制

1概述

2弯曲菌的耐药机制

2.1弯曲菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制

2.2弯曲菌对四环素类抗生素的耐药机制

2.3弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素的耐药机制

2.4弯曲菌对大环内酯类抗生素的耐药机制

2.5弯曲菌对磺胺类抗生素的耐药机制

2.6弯曲菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

2.7弯曲菌多重耐药机制

3总结

参考文献

第二章纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定弯曲菌耐药性的比较和分析

1材料和方法

1.1材料

1.2细菌复苏与培养

1.3药物敏感性实验

2结果

2.1药敏纸片扩散法测定弯曲菌耐药性结果

2.2微量肉汤稀释法测定弯曲菌耐药性结果

2.3微量肉汤稀释法与药敏纸片扩散法测定结果的比较

2.4药敏纸片扩散法的最佳条件

3讨论

参考文献

第三章弯曲菌耐药基因检测与分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1耐药基因在弯曲菌中的分布

2.2红霉素耐药菌株23S rRNA基因突变分析

2.3喹诺酮耐药菌株gyrA、gyrB基因突变分析

2.4半定量RT-PCR检测cmeB基因的表达

3讨论

参考文献

第四章基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对弯曲菌的分型研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1同一菌株质谱图重现性

2.2 9株弯曲菌MALDI-TOF MS分型结果

2.3 MALDI-TOF MS分型结果与耐药相关性分析

3讨论

参考文献

致谢