弯曲菌分离株PFGE分型、耐药性和毒力基因分布及相关性分析

摘要

弯曲菌(Campylobacter)是一种自限性革兰氏阴性菌，能引起全球范围内肠道疾病，严重的能够导致神经性疾病，引起人类弯曲菌病的主要是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。弯曲菌普遍定存在家禽体内尤其是鸡肠道，通过粪便排泄不断污染环境，人类直接接触或者消费鸡肉产品等间接途径会感染弯曲菌。近年来弯曲菌病的发生率及其耐药性的不断上升，严重影响人类健康。控制污染源、限制抗生素的使用可以提高弯曲菌病的治愈率。本研究主要目的是:(1)应用脉冲场凝胶电泳方法(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)对不同来源弯曲菌分离株进行PFGE分型，结合耐药性分析和毒力基因分布分析探究两者间的亲缘关系，最后对三种方法间的相关性进行研究。(2)对某屠宰厂鸡肉生产加工环节的弯曲菌分离株进行脉冲场凝胶电泳同源性分析，结合耐药性和毒力基因分布分析探究整个生产环节的交叉污染情况。
　　 一、空肠弯曲菌分离株PFGE、耐药性和毒力基因分型分析及相关性
　　 本研究对扬州市腹泻病人、鸡源和牛源空肠弯曲菌分离株进行PFGE、耐药性和毒力基因分布的研究。结果显示88株不同来源空肠弯曲菌分离株可分为9个PFGE型(PFGE types，PTs)，其中PT9包含30株细菌，占细菌总量的34.1％，为扬州地区主要PT。PT9中人源和鸡源空肠弯曲菌分离株居多，占PT9菌株总量的86.7％。其他PTs所包含菌株中，人源和鸡源弯曲菌同时存在的比例也较高，表明人源菌株和鸡源菌株亲缘关系近，人群腹泻可能和鸡相关。
　　 同一PT中，多数细菌毒力基因分布相似，少数细菌毒力基因分布存在完全相同，如PT2中57.1％的人源菌株毒力基因完全相同，PT9中63.6％的鸡源菌株毒力基因分布完全相同。同源性相对较低的PT2和PT3菌株，黏附类毒力基因的分布差异较大。不同PTs菌株的脂多糖、毒素以及趋向性类毒力基因分布差异较小，很多菌株表现出完全相同的分布。PT8和PT9的人源空肠弯曲菌PO-10、PO-17-7、PO-18-2等毒力基因分布相似，耐药性只在头孢哌酮上表现不同。PT7的牛源菌株XN-4-2、DJ-2-4、TZDN-8毒力基因分布差异很小，其耐药性高度相似。
　　 研究结果表明，空肠弯曲菌分离株的PT和毒力基因、耐药性不存在一一对应关系，但不同PTs空肠弯曲菌分离株中毒力基因相似度不同，PT8和PT9中人源菌株和鸡源、牛源菌株的耐药性相似度高。
　　 二、鸡肉生产加工环节弯曲菌交叉污染监测
　　 本研究利用PFGE分型，结合耐药性和毒力基因分布分析对南通某鸡肉生产加工厂不同屠宰环节进行交叉污染的监测。我们对同一批次鸡肉生产加工过程的7个环节进行监测，包括脱毛前、脱毛后、开膛后、盲肠内容物、消毒预冷、包装、冷冻环节。所分离的41株弯曲菌中，结肠弯曲菌38株，空肠弯曲菌3株。研究结果显示，38株结肠弯曲菌可以分为3个PTs，同源性高于90％。不同环节分离株PT普遍相同，说明不同环节分离株同源性较高。其中PT2的F46、F6，和PT3的B14、D52、F44、D59毒力基因分布和耐药性完全相同，说明这些菌株有可能来源于同一个体，反映了屠宰过程不同加工环节弯曲菌存在交叉污染现象。
　　 从屠宰环节来看，开膛后、盲肠内容物、包装环节都存在耐药性和毒力基因分布完全一致的细菌，说明同一环节可能存在交叉污染现象。除消毒预冷、冷冻环节，开膛后、脱毛后、盲肠内容物、包装环节毒力基因分布相同的菌株比较多，说明了开膛后、脱毛后、盲肠内容物、包装环节交叉污染比较严重，脱毛前、消毒预冷和冷冻环节交叉污染轻。
　　 PFGE分型对鸡肉生产加工过程不同环节弯曲菌分离株研究结果显示，此方法分辨率高，实用性强，灵敏度高，能够很好地进行菌株同源性分析，是一种非常有效的分子分型方法，建立弯曲菌PFGE指纹图谱数据库，能及时进行弯曲菌的追踪溯源，控制食源性疾病的发生。

目录

符号说明

第一章 综述

1 概述

2 基因分型

2．1 脉冲场凝胶电泳分型

2．2 多位点序列分型

2．3 单核苷酸多态性分析

2．4 扩增片段长度多态性分析

2．5 随机扩增多态性DNA分析

2．6 限制性片段长度多态性分析

2．7 核糖体分型

3 PFGE和其他分型方法的比较

3．1 PFGE和血清学分型的比较

3．2 PFGE和耐药性的比较

3．3 PFGE和噬菌体分型的比较

3．4 PFGE和其他基因分型方法的比较

4 以蛋白质为基础的分型

4．1 多位点酶电泳分型

4．2 质谱分析

参考文献

第二章 不同来源空肠弯曲菌分离株的PFGE分型、耐药性和毒力基因分布及相关性分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 空肠弯曲菌分离株PFGE和毒力基因分布的相关性

2．2 空肠弯曲菌分离株PFGE和耐药性的相关性

2．3 不同来源空肠弯曲菌分离株PFGE、耐药性和毒力基因分布之间的关系

2．4 不同来源空肠弯曲菌分离株PFGE和MLST结果分析

3 讨论

3．1 空肠弯曲菌分离株PFGE结果分析

3．2 PFGE分型和毒力基因分布相关性分析

3．3 PFGE分型和耐药性相关性分析

参考文献

第三章 鸡肉屠宰加工过程中弯曲菌交叉污染的监测

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PFGE结果

2．2 PFGE、耐药性和毒力基因分布的关系

3 讨论

3．1 毒力基因分布

3．2 耐药性分析

3．3 屠宰过程中交叉污染的分析

参考文献

致谢

声明