副溶血性弧菌传播特征、O3∶K6流行克隆分子生物学特性及多位点序列种群遗传研究

摘要

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种存在于海产品中的革兰氏阴性嗜盐性细菌，广泛布于全球河口、海洋和沿海环境。水温、盐份、浮游动物繁殖、潮汐的冲洗及溶解氧对副溶血性弧菌的时空分布有着重要影响。该菌于1950年在日本首次发现并被认为是引起食物中毒的重要病原菌，导致1996年以来世界范围沿海国家约50％以上细菌性食物中毒事件的爆发；副溶血性弧菌引起的爆发性食物中毒事件多发生于气温较高的月份里，一般认为是由食用海产品类食物引起。
　　 已知副溶血性弧菌毒力基因是tdh及trh，分别编码TDH及TRH毒素；TDH具有溶血活性、肠毒素活性、心脏毒素活性及细胞毒活性。1996年后在世界范围内出现了O3∶K6新血清型的流行，形成所谓的O3∶K6大流行克隆(pandemic clone)并导致副溶血性弧菌感染人数急剧上升。该菌首先在印度加尔各达、我国的台湾省、日本等地流行，随后蔓延到世界多数沿海国家包括美国、智利等。副溶血性弧菌大流行株RIMD2210633(1996年从日本获得的一株O3∶K6 tdh+菌株)全基因组序列公布为研究副溶血性弧菌特别是大流行克隆提供了重要参照基因序列。大流行株的出现主要是由于副溶血性弧菌通过大片段基因水平转移及基因重组，获得了toxRS/new、丝状噬菌体(orf8)基因等一系列系统性毒力基因及毒力基因岛，结果导致其对环境适应性和对人体侵入性增强。与其它致病性弧菌及杆菌不同，副溶血性弧菌拥有两套Ⅲ型分泌系统基因(T3SSs)：T3SS1、T3SS2。实验表明T3SS1与细胞毒性相关，而T3SS2与其产肠毒素相关，两套T3SSs在副溶血性弧菌的致病性方面可能有协同作用。但迄今为止，副溶血性弧菌的致病机理仍不完全清楚。
　　 副溶血性弧菌原先主要分类依据是血清型分型，当今，许多分子生物学分型技术，如核糖体分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、以及多位点序列分型(MLST)技术已经成功地用于该菌分子流行病学的研究。
　　 近年来，副溶血性弧菌是导致我国食物中毒事件的最重要的食源性致病菌之一，而我们发现多数由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件与海产品并无直接关系，因此副溶血性弧菌的传播途径可能发生了重要变化。在本研究中，针对中国大陆地区的副溶血性弧菌，开展其流行途径分析，寻找控制副溶血性弧菌传播关键控制点；同时对致病株、O3∶K6克隆在食物链中的存在状况、副溶血性弧菌的毒力基因、毒力基因与毒力岛之间关系进行研究，分析中国大陆O3∶K6克隆分子生物学特点；通过MLST种群遗传分子生物学研究，探索起源于亚洲的O3∶K6流行克隆始祖菌(ancestor strain)来源，破解大流行株克隆起源之谜。
　　 1.副溶血性弧菌传播特征及血清型多样性分析
　　 本章节分析了在流通过程中，农贸市场、大型超市及宾馆饭店销售/或加工的海产品及淡水产品中副溶血性弧菌污染状况，并对分离出的副溶血性弧菌进行RAPD分子分型；对来自水产品副溶血性弧菌菌株、食物中毒事件中收集菌株以及住院病人副溶血性弧菌分离株tdh和trh基因携带状况进行分析；分析食源性副溶血性弧菌血清型多样性。
　　 通过分子生物学及流行病学分析研究，明确提出了与传统意义上副溶血性弧茵传播方式不同的传播模式：从销售场所到餐桌流通过程中，副溶血性弧菌不仅通过海产品而且通过污染淡水产品及其它食品流行传播；农贸市场、大型超市、宾馆饭店的水产品销售和/或加工场所是副溶血性弧菌通过交叉污染、最终导致食物中毒及食源性疾病发生的关键场所。这一结论为制定HACCP以控制相应食源性疾病的措施提供了重要依据。
　　 通过P4引物分子分型，副溶血性弧菌RAPD主要分子型是A和B型；分子亚型A8和A6是主要毒力亚型。本研究提供了中国大陆地区相对完整的食源株血清型分布谱。食源性菌株血清型丰富且多变，共有9个O群61个血清型，O1、O3、O5、O10和O11是主要血清群，出现了30个新的血清型；与国际上共有11个O血清群不同，中国大陆地区未发现O7及O9血清群副溶血性弧菌。中国大陆食源性菌株中出现了与大流行克隆相关的血清型O3∶K6及O4∶K68，表明食物链中存在出现大流行株的潜在可能性。
　　 2.O3∶K6克隆流行特征及系统性功能基因研究
　　 在本章节中，对来自上海、江苏、浙江水产品、食品及食物中毒病人、食源性疾病哨点医院患者的510菌株进行分析，研究中国大陆是否存在O3∶K6克隆及O3∶K6克隆菌株在食物链中存在状况、血清型种类；进行tdh、toxRS/new、orf8、HU-a、VP2905、MTase(VP0394)系统性功能基因测定，以了解系统性功能基因在中国大陆副溶血性弧菌中存在状况。
　　 本研究证实：中国大陆副溶血性弧菌流行克隆属于亚洲地区O3∶K6流行克隆小生境。在食物链中的确存在大流行克隆且成为食源性疾病的主要致病原因。O3∶K6流行克隆主要血清型包括O3∶K6、O1∶KUT、O1∶K25、O1∶K26、O4∶K68以及国际上未发现的新血清型O1∶K36、O3∶K25、O3∶K68、O4∶K48。血清型O3∶K6是大流行株主要血清型，但在局部区域可以形成新的血清型大流行株。
　　 与已有的其它研究结论不同，本研究结果证明副溶血性弧菌可以以活的可培养状态越冬的，其感染致病模式可能发生改变即在寒冷温度下也可能以此种状态感染人类并引起腹泻。改变生食水产品习惯及加强从业人员带菌检查可以大大降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病的发生。
　　 本研究证实，副溶血性弧菌O3∶K6流行克隆拥有系统性功能基因orf8、HU-a、MTase、VP2905，此四个基因在副溶血性弧菌的致病性以及大流行株进化过程中起着重要的作用。尽管不是每株大流行菌株同时拥有，这四个基因是O3∶K6流行克隆所独有的并成为其标志性基因。此四个基因及toxRS/new基因及tdh基因形成了大流行克隆系统性功能基因，在快速鉴定及诊断致病性副溶血性弧菌方面有重要意义。
　　 3.副溶血性弧菌分离株毒力岛研究
　　 本章节中，对302株副溶血性弧菌进行了毒力岛VPaI-1～VPaI-7、2个T3SSs等其它基因片段携带情况进行研究。
　　 与国际上副溶血性弧菌O3∶K6克隆大流行株研究结果不同，中国大陆大流行株7个VPaIs毒力岛中，VPaI-1、VPaI-4、VPaI-5为大流行株独有的；毒力岛VPaI-1和VPaI-5对大流行株的形成最为重要，VPaI-4可能是副溶血性弧菌大流行克隆最后获得的毒力岛基因。毒力岛VPaI-6并不是大流行株所独有的，绝大多数副溶血性弧菌菌株包括大流行株、致病株及非致病株都拥有VPaI-6。毒力岛VPaI-7(包含T3SS2)与tdh基因密切相关，即拥有tdh基因的菌株都拥有VPaI-7。大流行株都拥有毒力岛VPaI-2及VPaI-3，但这2个毒力岛并非大流行株所独有的；部分tdh阳性致病株及少数非致病株同样可拥有VPaI-2，血清型为O3∶K6非致病株可拥有VPaI-3；因此，拥有毒力岛VPaI-2及VPaI-3的非致病菌株可能是由非致病株向大流行株进化过程中的中间体：即在非致病株进化为大流行株的过程中，血清型为O3∶K6的非致病株首先获得的毒力岛应是VPaI-3、VPaI-2。
　　 所有的副溶血性弧菌都拥有T3SS1。拥有完整的T6SS及Ⅰ型菌毛基因对大流行株的致病性来说具有重要意义。副溶血性弧菌拥有生物膜基因是副溶血性弧菌适应环境进化过程的需要。
　　 4.副溶血性弧菌多位点序列分析及O3∶K6克隆种群起源研究
　　 通过副溶血性弧菌MLST种群遗传分析，结合O3∶K6克隆系统性毒力基因及7个毒力岛VPaIs，研究中国大陆副溶血性弧菌MLST的型别特征并探索起源于亚洲、引起世界范围流行的O3∶K6克隆大流行株始祖菌(ancestor strain)。
　　 结果表明，中国大陆地区112株副溶血性弧菌分为45个ST型，1个同源复合体CC3，一个双联体D及38个独立型。中国大陆大流行株O3∶K6克隆与国际上大流行株克隆为同一来源，同属于以ST3为原始序列型的CC3克隆复合体。
　　 本研究探明起源于亚洲O3∶K6克隆的始祖菌。MLST种群遗传结果分析表明副溶血性弧菌ST3型与是否带有全部或部分系统性毒力基因及系列毒力岛之间没有必然的联系；大流行株O3∶K6克隆原始序列型ST3的始祖菌起源于血清型为O3∶K6、ST3型的非致病性环境株，该环境株通过大片段的基因片段水平转移进行基因重组，首先获得毒力岛VPaI-3、VPaI-2，继而获得VPaI-1、VPaI-5，最后获得毒力岛VPaI-4，形成了1996年前后引起大规模流行的O3∶K6大流行株；其后为适应环境变化通过基因水平转移而产生O∶K抗原的转换形成了包含一系列新的血清型的O3∶K6流行克隆。
　　 本研究CC3克隆复合体中发现了ST2、ST192、ST227、ST196、ST220复合体新成员，表明大流行株同源复合体看家基因进化速度快。携带有tdh、trh基因的致病株与CC3克隆复合体在遗传进化过程中没有特别的联系。MLST为监测副溶血性弧菌新的致病性同源复合体出现并及早实施预防提供了有效的技术支撑。

目录

文摘

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论文说明：符号说明

声明

综述一 副溶血性弧菌O3：K6流行克隆全球流行状况

引言

1副溶血性弧菌O3：K6大流行株起源及O3：K6克隆形成

2 O3：K6大流行株鉴定标准及不同血清型大流行株形成克隆能力

3副溶血性弧菌大流行株的全球传播

4 O3：K6流行克隆株和非流行克隆株之间生物特性及基因序列差异

5副溶血性弧菌流行克隆株生态学和流行病学

参考文献

综述二O3：K6克隆毒力(岛)基因、遗传特征研究

1副溶血性弧菌Ⅲ型分泌系统(T3SSs)

2副溶血性弧菌毒力岛与不同致病性弧菌毒力岛间的关系

2.1副溶血性弧茵基因与其它致病性弧菌基因组比较

2.2副溶血性弧菌AQ3810与RIMD2210633基因组序列比较

2.3高致病性副溶血性弧菌毒力岛

2.4副溶血性弧菌毒力岛基因与其它致病性弧菌基因组比较

3用多位点序列分型对副溶血性弧茵菌株进行分子系统发育学研究

参考文献

第一章副溶血性弧菌传播特性及血清型多样性分析

1材料和方法

1.1样品来源

1.2副溶血性弧菌分离与鉴定

1.3 DNA提取

1.4 PCR法测定tdh、trh基因

1.5 RAPD分子分型

1.6血清学分型

2 结果

2.1食物链中、可疑熟食及病人粪便中副溶血性弧菌的检出情况

2.2副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的检出情况

2.3副溶血性弧菌RAPD分子分型结果

2.4食源性副溶血性弧菌血清分型结果

3讨论

4 小结

参考文献

第二章O3：K6克隆流行特征及系统性功能基因研究

1材料和方法

1.1菌株来源

1.2血清分型

1.3 PCR法测定tdh、trh、系统性功能基因

2结果

2.1食源株中致病株及大流行株分布情况

2.2人源株中致病株及大流行株分布情况

2.3系统性功能基因的分布情况

3讨论

4 小结

参考文献

第三章副溶血性弧菌毒力岛研究

1材料和方法

1.1大流行株、致病株、非致病株的来源

1.2 PCR法测定毒力及毒力岛基因

2结果

2.1 T3SS1阅读框分布

2.2毒力岛VPaⅠ-1、Ⅰ-5的分布情况

2.3毒力岛VPaⅠ-4、VPaⅠ-6分布情况

2.4毒力岛VpaⅠ-7及T3SS2阅读框分布情况

2.5毒力岛VPaⅠ-2分布情况

2.6毒力岛VPaⅠ-3分布情况

2.7 T6SS、生物膜基因、Ⅰ型菌毛基因分布情况

3讨论

4 小结

参考文献

第四章副溶血性弧菌多位点序列分析及O3：K6克隆种群起源研究

1材料与方法

1.1菌株来源

1.2系统性毒力基因及7个毒力岛的测定

1.3 MLST测定

1.4确定同源(克隆)复合体

1.5系统发育分析

2结果

2.1副溶血性弧菌ST型

2.2 ST型别与血清型、系统性毒力基因及毒力岛间的关系

2.3同源性复合体

2.4集群和系统发育分析

3讨论

4 小结

参考文献

附件

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文