猪霍乱沙门菌强毒株与弱毒株基因组和蛋白质组差异分析

摘要

猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Choleraesuis)是引起2～4月龄仔猪副伤寒的主要病原。仔猪副伤寒可一年四季发生，多与猪瘟混合感染，具有较高发病率与死亡率，可造成重大损失。猪霍乱沙门菌同样对人类具有较高的致病性，常导致人发烧及败血病等全身性感染症状。此外，当前流行的猪霍乱沙门菌的多重耐药性严重，对人类健康的潜在威胁很大，因此猪霍乱沙门菌的防控备受关注。
　　 本研究利用抑制差减杂交技术(SSH)构建了猪霍乱沙门菌强毒株与弱毒株的差减文库，对差异序列进行了初步分析。利用蛋白质二维电泳技术(2-DE)以及实时荧光定量PCR分析了两菌株间相关蛋白的表达差异。
　　 1猪霍乱沙门菌强毒株与弱毒株抑制差减文库的构建及差异基因筛选
　　 利用抑制性差减杂交技术对猪霍乱沙门菌强毒株C78-2与弱毒株C500进行基因组片段的差异分析，成功构建了差减文库。经Dot-blot筛选后，对片段进行测序和同源性分析，结果在C78-2中发现了5个特异基因序列，分别为asr、ydgF、rpoS、ptsG和一个未知功能序列。同时，在C500株基因组中还发现大小为3290bp的DNA缺失区域，其内包含asr、ydgD、ydgE、ydgF等4个基因。该差减文库的建立为研究猪霍乱沙门菌弱毒株C500致弱机理提供了重要材料。
　　 2猪霍乱沙门菌强毒株与弱毒株比较蛋白质组学初步研究
　　 利用蛋白质二维电泳技术对猪霍乱沙门菌强毒株C78-2和弱毒株C500的菌体蛋白进行了比较研究。将得到的电泳图谱用PDQuest软件分析后，选择C78-2中特异的5个蛋白点进行了质谱分析，共有4个蛋白鉴定成功，成功率为80％。这些蛋白分别是CheY蛋白磷酸化酶CheZ、细菌铁蛋白、OsmY蛋白以及核糖-5-磷酸异构酶RptA。CheZ蛋白是CheY蛋白的磷酸化酶，是细菌趋化性的调节因子。细菌铁蛋白是一种铁储存血红素蛋白，与储存机体中过剩的铁，避免铁离子造成的细胞毒性有关。OsmY蛋白是细菌的一种周质蛋白，与细菌抵抗高渗透压环境有关。核糖-5-磷酸异构酶(RpiA)是一种磷酸戊糖途径和卡尔文循环中必需的酶。这些研究结果为了解猪霍乱沙门菌遗传进化、致弱机理等提供了一定的理论基础。
　　 3实时荧光定量PCR检测猪霍乱沙门菌相关蛋白体外表达差异
　　 根据猪霍乱沙门菌强毒株C78-2和弱毒株C500基因组和蛋白质组学比较结果，共设计8个基因的检测引物，包括rpoS、spvA，spvB、spvC、bfr、cheZ、osmY，rpiA，同时设计了猪霍乱沙门菌gmk的引物作为内参。提取两株猪霍乱沙门菌体外液体LB培养的总RNA，反转录成cDNAs，利用荧光定量PCR比较各基因在体外培养时mRNA的表达水平差异。结果表明：rpoS在C500中不表达，从而进一步证明了C500中rpoS的缺失。研究还发现，rpoS调控的spvA、spvB、spvC、osmY以及bfr、cheZ、rpiA在C78-2中的表达量显著高于C500，与预期结果相符。