东方山羊豆水通道蛋白基因的克隆及初步分析

摘要

东方山羊豆(Galega orientalis)为多年生豆科草本植物，具有利用年限长、春季返青后长势快、产量高、营养物质(特别是粗蛋白)含量高且家畜采食不易发生鼓胀病并促进奶牛泌乳等优点。东方山羊豆可以鲜草、青贮、干草及脱水粒状物等形式成为紫花苜蓿(Medicago sativa)的替代物。因此，是一个值得大面积推广的牧草品种。但在西北等盐碱地、干旱土地较多的地区，其推广种植受到了很大的限制，因此研究山羊豆抗旱耐盐基因，为东方山羊豆的抗逆性改良提供依据和参考。
　　 水通道蛋白AQPs属于古老的通道蛋白MIP(major intrinsic proteins)成员，在植物生长发育过程中介导多个生理途径。水通道蛋白能够增加生物膜对水分的透性，实现水分的长距离运输、快速跨膜转运；通过调节自身的关闭限制植物体内水分流失，维持水分，有效调节细胞内外的渗透平衡，从而增加植物对水分胁迫的耐受能力。水通道蛋白还参与其他小分子的共质体和跨细胞途径运输，从而参与调控植物的一系列重要生理过程，如光合作用、营养物质的吸收以及细胞信号转导和胁迫应答反应。
　　 本实验根据已知EST片段从东方山羊豆中克隆到一个水通道蛋白(AQP)基因，命名为GoAQP，并对其序列进行了生物信息学分析，基因表达特异性分析，基因表达载体构建及基因的亚细胞定位分析，以期验证GoAQP基因在水分胁迫下的功能，为东方山羊豆在西北等盐碱地、干旱土地较多的地区的种植推广奠定基础。
　　 本研究包括以下内容及结论：
　　 (1)GoAQP基因的克隆及生物信息学分析
　　 利用东方山羊豆盐胁迫下构建的抑制差减杂交文库中已知的GoAQP基因EST片段，结合RT-PCR和RACE技术，克隆得到一个水通道蛋白(AQP)基因，命名为GoAQP，并将其登录GenBank，登录号：HM803185。通过测序和生物信息学分析表明，此序列全长1258 bp，开放读码框(ORF)870 bp，编码289个氨基酸。GoAQP包含MIP家族信号序列HINPAVT/SFG，高等植物PIP高度保守序列GGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。运用TMHMM软件对GoAQP进行跨膜结构分析，发现其具有水通道蛋白典型的6个跨膜区。这些结果表明GoAQP为一个膜转运蛋白。将GoAQP蛋白氨基酸序列与拟南芥AQP基因家族的氨基酸序列进行系统进化分析表明，GoAQP属于PIP1亚型AQP蛋白。通过ProtFun功能预测软件预测，发现其具有运输功能的可能性最高。
　　 (2)GoAQP基因的表达特异性分析
　　 通过Real-Time PCR检测了GoAQP基因在东方山羊豆中的组织表达特异性和不同逆境处理下的表达特点，结果表明：GoAQP基因在根中表达量最高，茎中表达量最少；GoAQP基因表达受NaCl、PEG胁迫表达上调，NaCl表达呈双峰分布；外源激素ABA诱导GoAQP基因表达，初期表达上调并成双峰分布，后期随时间的增加而表达下调。表明GoAQP基因可能参与了东方山羊豆抗旱和耐盐性的调控，这些调控可能需要ABA信号途径的参与。
　　 (3)GoAQP基因超表达载体的构建及亚细胞定位分析
　　 成功构建超表达载体pCAMBIA-1302-GoAQP，为转基因验证基因功能创造了基础。同时利用基因枪转化洋葱表皮细胞，借助共聚焦显微镜进行蛋白亚细胞定位分析。结果表明GoAQP蛋白定位于细胞膜上。