东方山羊豆液泡膜Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白基因的克隆、表达分析和遗传转化

摘要

土壤中高浓度的盐导致了世界上许多作物大幅减产。植物耐盐基因工程被认为是培养耐盐作物、开发利用盐荒地最有效、最经济的手段，但缺乏有效的目的基因是限制植物耐盐基因工程进一步发展的瓶颈。植物液泡型Na+/H+逆向运转体利用液泡膜H+-ATPase和液泡膜H+-PPiase产生的跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡，同时将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡内积累。这不仅能够降低胞质内的Na+以维持胞质正常的K+/Na+比值，还可以有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂。 本研究根据柠条液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因CkNHX1设计引物，通过RT-PCR及RACE的方法从东方山羊豆中克隆了Na+/H+逆向转运蛋白基因。序列分析表明，该基因全长2280bp，开放读码框为1626 bp，可编码542个氨基酸残基。预测该蛋白分子量为60.0 kDa，碱性氨基酸41个；酸性氨基酸35个；疏水氨基酸231个；极性氨基酸144个。二级结构预测表明该蛋白含约44.18％的α-螺旋、19.96％的β-折叠、5.36％的β-转角和30.50％的不规则卷曲，可能有10个跨膜区域。系统发育分析表明该蛋白(GoNHX1)与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘较近，与质膜型的Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。RT-PCR检测结果表明，东方山羊豆在NaCl胁迫条件下GoNHX1基因在根、茎、叶中均有表达，东方山羊豆属于诱导型表达。将GoNHX1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内瞬时表达。在洋葱表皮细胞的液泡膜上观察到绿色荧光，表明GoNHX1定位于液泡膜。构建表达载体pCAMBIA1300-GoNHX1，以农杆菌介导的方法转化烟草。PCR结果表明：GoNHX1 cDNA已经插入转基因烟草基因组中。

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论文说明：缩写词表

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第一章引言

第二章国内外研究进展

1植物耐盐基因工程研究进展

1.1渗透调节物质合成基因

1.2编码逆境保护蛋白基因

1.3自由基清除的基因工程

1.4调节离子平衡的转运蛋白基因

1.5与信号转导和转录调控相关基因

2 Na+/H+逆向转运蛋白研究进展

2.1 Na+/H+逆向转运蛋白结构特征及亚细胞定位

2.2Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系

2.3 Na+/H+逆向转运蛋白基因的表达及调控机制

第三章材料与方法

1.材料

1.1植物材料

1.2菌株

1.3克隆载体

1.4酶与试剂

2方法

2.1GoNHX1基因中间片段的克隆

2.2东方山羊豆NHX基因3'端cDNA的克隆

2.3东方山羊豆NHX基因5'端cDNA的克隆

2.4东方山羊豆GoNHX1基因开放阅读框(ORF)全长的克隆及生物信息学分析

2.5东方山羊豆GoNHX1基因的半定量RT-PCR表达分析

2.6东方山羊豆GoNHX1基因的亚细胞定位

2.7东方山羊豆GoNHX1基因在烟草中的异源表达

第四章结果与分析

1 GoNHX1基因全长cDNA的克隆

1.1 GoNHX1基因中间片段的cDNA克隆

1.2 GoNHX1基因3'端cDNA的克隆

1.3 GoNHX1基因5'端cDNA的克隆

1.4 GoNHX1基因开放阅读框cDNA的克隆及全长序列拼接

2 GoNHX1基因生物信息学分析

3 GoNHX1与其它Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系比较

4 RT-PCR分析GoNHX1基因的表达特性

4.1东方山羊豆Actin基因的克隆

4.2 GoNHX1基因的半定量RT-PCR表达分析

5 GoNHX1的亚细胞定位

6 GoNHX1基因转化烟草的初步检测

6.1表达载体pCAMBIA1300-GoNHX1的酶切鉴定

6.2转GoNHX1基因的烟草植株的获得及鉴定

第五章讨论

1.GoNHX1基因的克隆及分析

2.GoNHX1基因的半定量表达

3.表达载体的构建、亚细胞定位及烟草转化

第六章结论

参考文献

在读期间发表论文

致谢