单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建及其蛋白质组学特性研究

摘要

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是重要的人畜共患李斯特菌病的病原菌，在食品公共卫生领域受到广泛关注，该菌的致病性与调控因子PrfA(positive regulatory factor A)蛋白作用下毒力基因的表达有着密切的关系。PrfA是李斯特菌最重要的毒力调控因子之一，能调节LIPI-Ⅰ、LIPI-Ⅱ上毒力基因的表达，从而对李斯特菌黏附及侵袭宿主细胞、逃离机体免疫应答起到调控作用。虽然目前对PrfA的调控作用有了一定的了解，但是其在Lm致病中的作用尚未完全阐明。本研究通过同源重组技术构建单核细胞增生性李斯特菌的prfA基因缺失株，并在此基础上对突变株的生物学特性和蛋白质组学特性进行鉴定，以期完善PrfA的调控机制，为Lm的致病机理研究提供科学依据。
　　 1、单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建
　　 采用PCR方法从单核细胞增生性李斯特菌LM4基因组中扩增出prfA基因的同源臂片段prs和picA。采用SOEing PCR方法将prs、plcA基因连接起来，将连接片段prs/plcA与pMD18-T载体相连并测序。测序正确的质粒经双酶切回收后插入穿梭载体pKSV7中，构建成重组穿梭质粒pKSV7-prs/plcA。将质粒电转化到LM4中，在温度和氯霉素抗性双重选择压力下传8代进行同源重组，然后在无选择压力下传10代将质粒丢失，最终获得prfA基因缺失的菌株LM4△prfA。在LM4△prfA的回复突变实验中，将pefA基因扩增出来并连接到表达载体pERL3质粒中，转化到DH10β中进行测序。将测序正确的质粒电转到LM4的prfA基因缺失株中，获得LM4△prfA的回复突变株。
　　 2、单核细胞增生性李斯特菌PrfA的生物学功能的研究
　　 在获得LM4△prfA的基础上，对PrfA的生物学特性进行研究。突变株与其亲本株的生长曲线、生理生化特性、对药物的药敏性无显著差异，表明PrfA对生长代谢的影响作用不显著。溶血实验中LM4的溶血效价为24，LM4△prfA的溶血效价为0，突变株丧失溶血能力，而prfA回复突变株的溶血活性得以完全恢复，表明PrfA对hly基因具有调控作用。肌醇磷脂酶与卵磷脂酶实验中LM4的周围均出现透明圈，而LM4△prfA没有出现此现象，说明突变株细菌失去了磷脂酶活性。生物膜形成实验中，LM4的OD590值为0.8478，LM4△prfA的OD590值为0.6772，prfA缺失株与其亲本株之间生物膜形成能力差异显著(p<0.05)，表明prfA的缺失可影响生物膜的形成。在细胞侵袭实验中，LM4的侵袭率为1.68％，LM4△prfA为0.38％，显示突变株的侵袭力显著下降(p<0.01)。对BALB/c小鼠的LD50实验结果表明，突变株的毒力较亲本株下降了105个数量级，突变株毒力显著降低。
　　 3、单核细胞增生性李斯特菌PrfA缺失株及其亲本株分泌蛋白的比较蛋白质组学研究
　　 本研究采用二维凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)，从蛋白质水平上研究PrfA的调控功能。实验采用基础培养基培养LM4及LM4△prfA，离心菌液并用三氯乙酸(TCA)对离心后的培养上清进行沉淀，从而获得分泌蛋白。二维凝胶电泳图谱的差异表达分析显示有31个点，质谱鉴定成功19个点，对应12种蛋白。结果发现己知的毒力相关蛋白有InlC、ActA、LLO，此外还新发现了一些受PrfA调控的蛋白，包括丙氨酸丙氨酰羧肽酶、GW重复表面蛋白。结合实时荧光定量PCR方法对蛋白质组学方法进行验证，结果显示hly、actA、inlC的基因表达量显著下降，丙氨酰氨羧肽酶、GW重复表面蛋白的合成也有降低，这些蛋白与PrfA之间的关系还要进一步研究。
　　 本研究成功构建了单核细胞增生性李斯特菌prfA缺失株LM4△prfA，并对缺失株和亲本株的生物学特性进行了系统研究，有力证明了PrfA对LIPI-Ⅰ，LIPI-Ⅱ上毒力基因的调控作用，并用比较蛋白质组学方法对PrfA的调控作用进行了探索。