ChTLR15基因的多态性和脾脏中的表达水平与肠炎沙门氏菌感染的相关性研究

摘要

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是当前养禽业较为普遍且不易受重视的食物源性病原菌,成年鸡表现为隐性感染且长期排菌,容易为生产所忽视,对禽类生产造成的直接和间接经济损失无法估量,而且对人类的身体健康也造成很严重的危害。从长远发展考虑,寻求一种全新的预防与控制策略,采用遗传学方法,培育出抗病新品种(品系),从遗传素质上永久性地提高鸡群对肠炎沙门氏菌的抵抗能力,培育高效、优质、抗性鸡种是实现养禽业可持续发展的迫切需要。
　　 一直以来,遗传学家和免疫学家都推崇“基因决定动物抗性学说”,即一些动物传染性疾病的发病机制与动物本身的遗传背景有关,可能受单个或多个抗性基因控制,亦即动物可能对一些传染性疾病存在完全或部分抵抗力。宿主的遗传背景对SE的抗性有着深远的影响,探索相关基因的差异表达规律是研究鸡对SE抗性的必要途径。因此必须立足于基本,对国内地方鸡种肠炎沙门氏菌抗性遗传基础进行深入研究,是解决国内地方鸡种肠炎沙门氏菌病抗病育种的关键科学问题。
　　 Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一种先天免疫模式识别受体,可通过识别并结合一种或多种病原相关分子模式,将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应,其为疾病机制的研究提供了方向,成为目前研究禽类抗病力的重要候选标记基因之一。TLR15是近来发现的禽类所特有的Toil样受体,目前的研究和发现提示鸡TLR15(ChTLR15)与鸡肠炎沙门氏菌病抗性存在着密切关系,关于ChTLR15在家禽异嗜性粒细胞中的表达水平以及其和家禽抵抗病原微生物的感染能力的关系是最近研究的焦点。宿主的遗传背景对SE的抗性有着深远的影响,不同种属动物的抗性基因对特定病原菌产生毒素的敏感性和引发的免疫反应类型差异很大,探索相关基因的差异表达规律足研究鸡对SE抗性的必要途径。
　　 本研究以中国地方鸡种存在对肠炎沙门氏菌抗性的遗传差异为切入点,进行肠炎沙门氏菌攻毒试验,以模式识别受体相关基因ChTLR15作为研究对象,从mRNA和DNA水平,采用以实时荧光定量PCR为主的基因差异表达分析,结合基因序列多态性扫描,探讨肠炎沙门氏菌攻毒后对中国地方鸩生长早期脾脏TLR15 mRNA表达的影响,为进一步揭示TLR15与鸡肠炎沙门氏菌病抗性的相关性和中国地方鸡种肠炎沙门氏菌抗病力差异的分子遗传机理提供科学依据和技术支撑。本研究分以下三部分:
　　 1清远麻鸡和白耳鸡SE天然感染率的比较以及ChTLR15基因多态性分布与SE感染的关系
　　 本研究以中国地方鸡品种清远麻鸡和白耳鸡种母鸡为研究对象,通过平板凝集试验对两个世代进行沙门氏菌自然感染情况的评估,白耳鸡和清远麻鸡世代1的鸡白痢阴性感染率分别为41.41％和58.82％,世代2的阴性感染率分别为48.83％和66.3％。白耳鸡和清远麻鸡世代1肠炎沙门氏菌阴性感染率分别为68.69％和76.47％。结果提示天然感染率的结果相对稳定,清远麻鸡对鸡白痢和肠炎沙门氏菌的天然感染率均低于白耳鸡,提示清远麻鸡的易感性低于白耳鸡。通过PCR-SSCP的方法对清远麻鸩和白耳鸡ChTLR15基因仅有的一个外显子区域进行单核苷酸多态性(SNPs)扫描,共检测到三个多态位点,分别为G168A、C726T和A1166G的突变。其中,G168A和C726T为沉默突变,A1166G引起编码氨基酸由赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。分析三个SNPs基因型频率和基因频率分布,发现G168A在两个品种间基因型分布无显著差异(P＞0.05);C726T和A1166G在白耳鸡与清远麻鸡基因型分布差异显著(P＜0.05,P＜0.01)。群体遗传特性分析发现,G168A位点在白耳鸡群中为低度多态(PIC＜0.25),在清远麻鸡群为中度多态(0.5＞PIC＞0.25);C726T位点在白耳鸡群和清远麻鸩群为中度多态(0.5＞PIC＞0.25);在A1166G位点白耳鸡达到高度多态(PIC＞0.5),而清远麻鸡在该位点为低度多态。分析ChTLR15基因SNP位点的基因型分布与肠炎沙门氏菌感染情况的相关性,发现白耳鸡C726T多态位点的基因型在感染阳性组和阴性组间的分布差异显著(x2=8.84,P＜0.05),阴性组BB基因型数明显多于阳性组,B(T)等位基因频率阴性组比阳性组高18％,提示T等位基因可能是抵抗肠炎沙门氏菌感染的有利基因。其它SNP位点在感染阳性组和阴性组间的分布均无显著差异,提示G168A、C726T(在清远麻鸡中)和A1166G突变位点基因型分布与肠炎沙门氏菌感染无明显相关。
　　 2清远麻鸡和白耳鸡雏鸡肠炎沙门氏菌LD50测定以及肠炎沙门氏菌感染对雏鸡生长的影响
　　 为评价清远麻鸡和白耳鸡对肠炎沙门氏菌的敏感性,先后进行两次半数致死量试验,试验一未设性别分组,试验二进行性别分组,将沙门氏菌母源抗体0效价雏鸡分别分为一个对照组和四个攻毒组,2日龄时经颈部皮下注射途径分别对各攻毒组雏鸡接种106、107、108、109 cfu剂量组的肠炎沙门氏菌,对照组注射PBS。观察接种后各实验组鸡的临床变化和死亡情况,进行细菌学鉴定,测定半数致死量(LD50),试验一清远麻鸡和白耳鸡的LD50的结果分别为5.89×107cfu和1.10×108cfu,试验二分别为1.29×108 cfu和1.5×108 cfu,其中雄性清远麻鸡和白耳鸡LD50分别为3.18×108 cfu和1.29×108 cfu,雌性清远麻鸡和白耳鸡LD50分别为4.22×107 cfu和1.79×108cfu。LD50的结果表明两个鸡种对肠炎沙门氏菌病的敏感性在品种和性别间差异不显著。细菌分离攀定结果显示,SE在感染雏鸡肝、脾、肺、肾和盲肠中均有分布,且经鉴定与接种菌株一致,各攻毒组脏器均表现出不同程度的病变。通过LD50结果,选择100％存活的106cfu剂量组进行攻毒,观察对照组和攻毒组生长情况,并于第1,3和10天采集脾脏样本。肠炎沙门氏菌攻毒后,清远麻鸡和白耳鸡的增重受到处理和日龄交互效应的显著影响,在品种内(F197=7.7,P=0.000;F342=16.1,P=0.000)和品种间(F142=7.5,P=0.000;F439=16.8,P=0.000)都差异极显著。白耳鸡在PBS处理后的第1天,对照组体重显著低于出雏重(P=0.0257),体重呈现负增长,此体重下降可能足由于受到抓捕刺激引起的,在处理后第3天,对照组试验鸡体苇开始正增长,显著高于出雏重(P=0.0000);而清远麻鸡对照组的体重在试验时间内一直表现为正增长,这一结果提示清远麻鸡的抗逆能力比白耳鸡强。白耳鸡在攻毒后的第1天和第3天攻毒组体重均显著低于出雏重(P=0.0047,0.0003),体重呈现负增长:到攻毒后第8天攻毒组体重才超过出雏重,说明白耳鸡攻毒组的生长受到严重的阻滞;清远麻鸡攻毒组体重虽然一直低于对照组,但是在攻毒的第1天,攻毒组体重和出雏重没有差异(P=0.1446),在攻毒后第3天,已经显著高于出雏重(P=0.0000),表现出正增长。攻毒组除了受到抓捕应激外还受到肠炎沙门氏菌攻毒的影响,在攻毒剂量一致和白耳鸡的出雏重高于清远麻鸡(P=0.000)的情况下,提示白耳鸡比清远麻鸡对肠炎沙门氏菌感染更加敏感。
　　 3ChTLR15 mRNA在脾脏中表达水平的变化与肠炎沙门氏菌感染关系的研究
　　 通过实时荧光定量PCR的方法,比较两个品种鸩脾脏样品中攻毒组和对照组(试验二)ChTLR15 mRNA相对表达量的变化。结果显示,与对照组相比,在三个时间点两个品种试验鸡脾脏中ChTLR15 mRNA的表达均显著上调,其中白耳鸡在感染后第1天他和第3天攻毒组ChTLR15的表达均极显著上调(P=0.003,0.001),清远鸡在感染后三个时间点攻毒组ChTLR15的表达水平均呈现极显著上调(P=0.016,0.002,0.001)。白耳鸡的攻毒组内和清远麻鸩的攻毒组内ChTLR15的表达在时间上没有显著差异,说明在肠炎沙门氏菌感染过程中,脾脏中ChTLR15 mRNA从第1天到第12天表现为持续的高表达。在攻毒后第1天,清远麻鸡攻毒组的ChTLR15表达显著低于白耳鸡;其他时间点清远麻鸡和白耳鸡对照组和攻毒组ChTLR15的mRNA表达没有差异。综上所述,ChTLR15基因在鸡沙门氏菌感染过程中参与了免疫应答反应。