西尼罗河病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用

摘要

西尼罗河病毒(West Nile Virus,WNV)和日本乙型脑炎病毒(JEV)同属于黄病毒科黄病毒属日本乙型脑炎病毒血清群,该群病毒属于蚊媒病毒,主要由鸟类携带,经蚊虫传播给人和马等哺乳动物。WNV于1937年首次分离自非洲乌干达西尼罗河地区一名患病妇女血液中,1999年在美国纽约爆发,引起人们恐慌和重大经济损失,国际兽医局(OIE)已将其列为法定报告动物疫病。我国是JEV疫区,两者存在血清学交叉反应,为了防止WNV的入侵,排除可疑病例,因此我们有必要建立起一种鉴别诊断方法作为技术储备。
　　 囊膜蛋白E是WNV重要的结构蛋白,其结构域Ⅲ上含有WNV特异性的抗原表位,其主要的中和表位位于结构域Ⅲ外表面的E307,E330,E332残基上,该区域始终被认为是与受体结合的区域,通过对这个区域的中和抗原表位识别可以区分JEV、黄热病毒、登革热病毒和墨累河谷脑炎病毒(MVEV)等一些黄病毒。
　　 根据GenBank上公布的WNV NY99毒株和JEV SA14-14-2毒株序列,分别设计合成扩增其E基因结构域Ⅲ序列的特异性引物,通过PCR和RT-PCR分别扩增E蛋白结构域Ⅲ基因,长度分别为378bp和481bp。参照分子克隆实验指南方法,将目的基因克隆到pET-32a(+)表达载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及测序证实了结构域Ⅲ基因以正确的阅读框架插入了pET-32a(+)载体。利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,运用SDS-PAGE电泳分析可见其相对分子质量分别约为30kDa和35kDa,并通过His·Bind亲和层析对重组蛋白进行了纯化。通过Western-blot和间接ELISA对本实验室保存的3株单抗进行特异性鉴定,筛选出特异性强的2株单抗(8F4A4,6H381),为建立能够鉴别诊断JEV抗体和WNV抗体的竞争ELISA方法提供了竞争检测抗体。
　　 以纯化的WNV囊膜蛋白E结构域Ⅲ作为抗原包被ELISA反应板,单抗8F4A4作为竞争检测抗体,通过方阵试验确定了重组EⅢ蛋白抗原的最佳包被浓度和单抗最佳稀释度,同时改变血清稀释倍数、包被条件及竞争反应时间、封闭液、酶标二抗稀释度及作用时间、底物最佳作用条件等因素,确定了最佳反应条件。结果表明:重组蛋白最佳包被浓度为530ng/mL,单抗的最佳稀释倍数为1:8000,待检血清的最佳稀释倍数为1:10。本研究在国内首次建立了检测WNV抗体的竞争ELISA方法,特异性试验证实该方法能够与我国流行的JEV进行鉴别诊断。对临床56份阴性样品进行检测计算出该方法的临界值为30％,以此为判定标准对送检的711份血清进行检测,结果均为阴性。此方法的建立弥补了商品化试剂盒不能区分JEV和WNV感染的缺陷,为我国西尼罗河病毒病的流行病学调查提供了一种有效的抗体检测方法。