巨型艾美球虫免疫原性相异株间消减cDNA文库的构建及其差异表达基因分析

摘要

鸡球虫病(Coccidiosis)是由数种艾美球虫(Eimeria)寄生在鸡肠道黏膜细胞内引起的一种寄生性原虫病。在鸡的各类疾病中，球虫病发病率最高，是养禽业危害最严重的禽病之一。目前，鸡球虫病的防治仍然以药物预防为主，但随着耐药虫株的广泛出现，药物预防的效果越来越差，而且药物的长期使用会残留肉蛋，污染环境，影响人体健康，故球虫病的防治趋势由药物转向了免疫预防。巨型艾美球虫(Eimeria.maxima)是在田间最常见的3种球虫之一，具有最强的免疫原性和一定的交叉免疫保护力，故在球虫疫苗中，E.maxima是不可缺少的虫种之一，但E.maxima在不同株间抗原变异最显著，有时可因疫苗株与田间株间的抗原差异而导致免疫效果不佳，甚至失败。本实验室前期研究发现，巨型艾美球虫上海株(SH strain)和南通株(NT strain)在免疫原性方面存在着显著的差异，即上海株仅对同源株攻击产生免疫保护力，而南通株对同源株与异源株攻击均能产生免疫保护力。为了探索这两株球虫在免疫原性上差异的分子基础，本文开展了下列研究工作。
　　 1 E.maxima SH株和NT株未孢子化卵囊阶段消减cDNA文库的构建
　　 用常规方法分别从E.maxhna SH株和NT株未孢子化卵囊中提取总RNA，并用纤维素柱纯化得到mRNA。在分别用球虫的mRNA为模板进行反转录获得cDNA后，分别以SH株cDNA为试验组(tester)，NT株cDNA为驱动组(driver)，或相反以NT株cDNA为tester，SH株cDNA为驱动组driver，经过两轮消减杂交和两轮抑制性PCR后，将PCR产物连接pGEM-T Easy载体，并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，经过蓝白斑筛选，分别构建了2个抑制性消减文库。随机从两个消减文库中挑取阳性克隆，用接头引物nest primer1和nest primer2R进行PCR扩增，经PCR鉴定显示E.maxima SH株和E.maxima NT株未孢子化卵囊消减cDNA文库的重组率分别为95％(284/300)和89％(231/261)，差异基因片段大小分布在0.25 kb～1.0 kb之间。
　　 2 E.maxima SH株和NT株未孢子化卵囊阶段消减cDNA文库中差异表达基因的筛选与分析
　　 首先，用地高辛标记方法制备了4种探针，即SH株消减组cDNA探针、SH株未消减组cDNA探针和NT株消减组cDNA探针、NT株未消减组cDNA探针。随后，分别用同源株消减组探针和异源株未消减组探针对同一克隆进行检测，筛选差异表达克隆。在被检测的515个克隆(SH株284个，NT株231个)中，共获得86个差异表达克隆，其中SH株63个，NT株23个。对差异表达克隆测序和同源性比对，共获得10个重叠群(Contigs)，其中SH株6个，NT株4个。通过BLAST分析，SH株的6个contigs中5个见有同源序列，1个未见同源序列，可能为新基因；NT株的4个contigs中3个见有同源序列，1个未见同源序列，可能为新基因。最后，选取6个差异表达基因，根据其序列分别设计引物，进行RT-PCR检测，结果发现这些基因在两个虫株内均有表达；随后又从RT-PCR验证的6个差异表达基因中选取2个基因，重新设计引物进行实时定量PCR验证，结果显示这2个差异表达基因在SH株和NT株中确实存在着表达量上的差异。