ATHK1和GPA1基因在PEG诱导脯氨酸和脱落酸合成中的作用及光的影响

摘要

逆境胁迫下植物细胞内脯氨酸和ABA含量显著升高，二者都在植物逆境应答中发挥重要作用。本实验以拟南芥ATHK1，G蛋白α亚基GPA1基因的缺失突变体和相应的野生型为材料，研究了PEG模拟干旱胁迫下脯氨酸和ABA积累的机制以及ATHK1、GPA1在脯氨酸和ABA积累过程中的作用，实验所得主要结果如下:
　　 1.各基因型拟南芥的脯氨酸和ABA含量均随PEG处理时间的增加而上升，表明PEG可诱导拟南芥脯氨酸和ABA的积累，PEG处理12h后，athk1的脯氨酸含量和ABA含量均低于Ws，gpa(1)-4的脯氨酸含量低于Col，但ABA含量与Col相差不大，表明ATHK1参与了PEG诱导的脯氨酸和ABA的积累过程，GPA1参与了PEG诱导的脯氨酸积累过程，但不参与PEG诱导的ABA积累过程。
　　 2.利用Fluridone处理结合外源施加ABA的研究发现:Fluridone预处理可降低PEG处理后游离脯氨酸的含量，并且Fluridone的抑制效应可被外源施加ABA解除，表明PEG诱导的脯氨酸积累过程在一定程度上依赖于ABA。在athk1中，PEG处理12h后脯氨酸含量低于Ws，且PEG处理的同时施加外源ABA可弥补其脯氨酸含量的亏缺，表明ATHK1以ABA依赖的方式参与了脯氨酸的积累过程。在gpa(1)-4中，PEG处理12h后脯氨酸的含量低于Col，且PEG处理的同时施加外源ABA不能弥补其脯氨酸含量的亏缺，表明GPA1对脯氨酸积累的调控是不依赖ABA的。
　　 3.利用IMD处理结合外源施加H2O2的研究发现:IMD预处理可降低PEG处理后游离脯氨酸的含量，并且IMD的抑制效应可被外源施加H2O2解除，表明H2O2参与了PEG诱导的脯氨酸积累过程。在athk1中，PEG处理12h后脯氨酸的含量低于Ws，且PEG处理的同时施加外源H2O2可弥补其脯氨酸含量的亏缺，表明ATHK1通过依赖H2O2的方式调控了PEG胁迫下脯氨酸积累的过程。在gpa(1)-4中，PEG处理12h后脯氨酸的含量低于Col，且PEG处理的同时施加外源H2O2不能弥补其脯氨酸含量的亏缺，表明GPA1对脯氨酸积累的调控是不依赖H2O2的。
　　 4.黑暗条件下，拟南芥脯氨酸含量十分低，给予光照后，脯氨酸含量随光照强度的增加而逐渐上升，表明光照能够诱导脯氨酸的积累。在50μM·m-2·s-1白光条件下，athk1和gpa1-4的脯氨酸含量均高于各自野生型，但在300μM·m-2·s-1白光条件下，athk1和gpa(1)-4的脯氨酸含量与各自野生型相比差异不大，表明ATHK1和GPA1负调控50μM·m-2·s-1白光诱导的脯氨酸积累，但不参与300μM·m-2·s-1白光诱导的脯氨酸积累过程。与50μM·m-2·s-1白光处理相比，50μM·m-2·s-1.蓝光处理对Ws生态型拟南芥的脯氨酸含量影响不大，但可提高Col生态型拟南芥的脯氨酸含量，表明蓝光可诱导Col生态型拟南芥脯氨酸的积累。在50μM·m-2·s-1蓝光处理下，gpa(1)-4植株的脯氨酸含量与50μM·m-2·s-1白光处理组变化不大，表明GPA1参与了蓝光诱导Col生态型拟南芥植株脯氨酸积累的过程。
　　 5.PEG处理下脯氨酸积累的量随光强的增加而上升，表明PEG诱导脯氨酸积累的过程受到光的激活。在50μM·m-2·s-1白光条件下，PEG处理后athk1的脯氨酸含量与Ws同处理组相比差异不大，但在300μM·m-2·s-1白光条件下，PEG处理后athk1的脯氨酸含量低于Ws同处理组，表明ATHK1参与了300μM·m-2·s-1白光条件下PEG诱导脯氨酸积累的过程，但不参与50μM·m-2·s-1白光条件下PEG诱导脯氨酸积累的过程。不论在50μM·m-2·s-1白光还是在300μM·m-2·s-1白光条件下，PEG处理后gpa(1)-4的脯氨酸含量均低于Col同处理组，表明GPA1既参与50μM·m-2·s-1白光下又参与300μM·m-2·s-1白光条件下PEG诱导脯氨酸积累的过程。不论在Ws还是Col中，50μM·m-2·s-1蓝光条件下PEG处理后的脯氨酸含量均低于50μM·m-2·s-1白光条件下的同处理组，表明50μM·m-2·s-1蓝光可抑制PEG诱导脯氨酸积累的过程。在50μM·m-2·s-1蓝光条件下，PEG处理后athk1的脯氨酸含量低于50μM·m-2·s-1白光同处理组，与野生型Ws的变化趋势一致，但gpa(1)-4的脯氨酸含量与50μM·m-2·s-1白光同处理组相比无明显变化，表明GPA1参与了50μM·m-2·s-1蓝光抑制PEG诱导脯氨酸积累的过程。
　　 综上所述，逆境胁迫可诱导脯氨酸和ABA含量上升，脯氨酸的积累在一定程度上依赖于ABA和H2O2，光强和光质也影响着脯氨酸的积累过程，ATHK1、GPA1也在一定程度上调控了上述过程。

目录

摘要

缩写表

1 文献综述

1．1 植物耐旱机理概述

1．2 ABA与植物耐旱

1．2．1 ABA及其生理功能

1．2．2 干旱胁迫下ABA的合成与积累

1．2．3 ABA信号的识别

1．2．4 胞内ABA信号的转导

1．2．5 ABA调控基因表达

1．3 脯氨酸与植物抗旱

1．3．1 脯氨酸是典型的渗透调节物质

1．3．2 脯氨酸的合成与分解代谢

1．3．3 脯氨酸代谢的调控

1．3．4 脯氨酸的转运

1．3．5 影响脯氨酸代谢的其它因素

1．4 ATHK1是拟南芥中可能的渗透感知分子

1．4．1 大肠杆菌双组分系统简介

1．4．2 酵母双组分系统简介

1．4．3 拟南芥ATHK1蛋白简介

1．5 植物G蛋白及其信号转导系统简介

1．5．1 哺乳动物G蛋白简介

1．5．2 植物G蛋白简介

1．5．3 植物G蛋白信号转导过程简介

1．6 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 植物材料

2．1．2 各种酶与试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 拟南芥的栽培及护理

2．3 拟南芥的实验处理及取样

2．4 实验方法

2．4．1 表型分析

2．4．2 离体叶片失水速率测定

2．4．3 脯氨酸含量测定

2．4．4 ABA含量测定

2．4．5 RT-PCR实验方法

3 实验结果

3．1 各基因型拟南芥植株抗旱能力的比较

3．1．1 PEG处理下各基因型拟南芥植株的表型分析

3．1．2 各基因型拟南芥植株离体叶片失水速率比较

3．2 PEG对各基因型拟南芥脯氨酸积累的影响

3．2．1 PEG对各基因型拟南芥游离脯氨酸含量的影响

3．2．2 PEG处理对各基因型拟南芥脯氨酸合成关键基因AtP5CS1表达量的影响

3．3 PEG对各基因型拟南芥ABA积累的影响

3．3．1 PEG对各基因型拟南芥游离ABA含量的影响

3．3．2 PEG对各基因型拟南芥ABA合成关键基因AtNCED3表达量的影响

3．3．3 PEG对各基因型拟南芥ABA合成关键基因AtAAO3表达量的影晌

3．3．4 PEG对各基因型拟南芥ABA积累相关基因AtBG1表达量的影响

3．4 脯氨酸积累与ABA的关系研究

3．4．1 ABA生物合成抑制剂Fluridone对各基因型拟南芥脯氨酸含量的影响

3．4．2 外源ABA对各基因型拟南芥脯氨酸含量的影响

3．5 脯氨酸积累与H2O2的关系研究

3．5．1 NADPH氧化酶抑制剂IMD对各基因型拟南芥脯氨酸含量的影响

3．5．2 外源H2O2对各基因型拟南芥脯氨酸含量的影响

3．6 光对脯氨酸含量的影响

3．6．1 不同光照处理对各基因型拟南芥脯氨酸含量的影响

3．6．2 光对PEG诱导各基因型拟南芥脯氨酸积累的影响

3．6．3 光强对PEG诱导各基因型拟南芥脯氨酸积累的影响

3．6．4 光质对PEG诱导各基因型拟南芥脯氨酸积累的影响

4 结论与讨论

4．1 ATHK1、GPA1在PEG诱导脯氨酸积累过程中的作用

4．1．1 ATHK1、GPA1参与了PEG诱导脯氨酸积累的过程

4．1．2 ATHK1、GPA1调控脯氨酸积累的机制探讨

4．2 ATHK1、GPA1在PEG诱导ABA积累过程中的作用

4．2．1 ATHK1参与了PEG诱导ABA积累的过程

4．2．2 ATHK1调控ABA积累的机制探讨

4．3 逆境下脯氨酸和ABA代谢的调控是多层次的

4．4 脯氨酸积累与ABA的关系

4．5 脯氨酸积累与H2O2的关系

4．6 光对脯氨酸积累的影响

4．7 总结与展望

5 参考文献

致谢

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