亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis幼虫酚氧化酶原激活蛋白酶cDNA克隆和表达分析

摘要

为研究亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidaseactivatingproteinase，PAP)表达调控的分子机理，本研究通过RACE技术获得该基因的cDNA序列，对PAP基因序列进行了生物信息学，通过原核表达并纯化了表达产物，采用Westernblot和酶活测定进行鉴定。对玉米螟幼虫进行细菌注射，通过RealtimePCR检测注射前后PAP基因在不同组织中mRNA水平上的表达变化情况。主要研究结果如下:
　　 (1)采用RT-PCR及RACE技术从亚洲玉米螟幼虫中克隆PAP基因全长cDNA序列。该基因全长1455bp，开放阅读框为1200bp，编码400个氨基酸;5’和3'非编码区分别为66bp和189bp。PAP的计算分子量约为44.8kDa，估测等电点pI为6.66。生物信息学分析表明:该基因序列中含有丝氨酸蛋白酶样结构域中保守的催化三联体，含有两个发夹结构域(Clip)，分别为位于23-70位氨基酸的结构域和153-394位氨基酸的结构域，其中153-394位氨基酸也被称为丝氨酸蛋白酶结构域(serineproteinase，SP)。PAP蛋白无跨膜结构域，无糖基化位点，N端含有信号肽，切割位点为18与19位氨基酸之间，含有19个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明:该片段的氨基酸序列与鳞翅目烟草天蛾ManducasextaPAP3precursor、ManducasextaPAP3、ManducasextaPAP2、家蚕BombyxmoriPPAE、蓖麻蚕SamiacynthiariciniPAP和斜纹夜蛾SpodopteralituraPPAE3氨基酸序列具有较高的同源性，其氨基酸一致性在37％以上。构建系统发育树，对其进化关系进行了初步分析，结果显示:亚洲玉米螟PAP与烟草天蛾PAP3和斜纹夜蛾PPAE3的亲缘关系较近，与甲壳纲的印度明对虾FenneropenaeusindicusPPAF和斑节对虾PenaeusmonodonPPAE亲缘关系较远。
　　 (2)为了对PAP蛋白进行结构分析，对PAP含有第二个Clip（153-394位氨基酸）的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域进行了亚克隆，分别获得了3个不同片段:PAP-SP1（144-400位氨基酸）、PAP-SP2（154-400位氨基酸）和PAP-SP3（44-400位氨基酸）。采用pET表达系统对PAP蛋白和SP结构域分别进行了原核表达，PAP全酶蛋白在IPTG的梯度诱导之后在沉淀均有大量表达，重组表达的蛋白质分子的大小与预测蛋白分子量大小一致，约为46.64kDa。pET-28b-PAP-SP1在37℃温度下，可以明显看到0.2mmol/L和0.1mmol/LIPTG诱导下有明显的蛋白表达。pET-28b-PAP-SP2在28℃温度诱导下，可以明显观察到0.1mmol/LIPTG诱导下蛋白在上清有明显表达。PAP-SP3通过构建融合表达载体并进行诱导表达发现pET-28a-HMsbT-PAP-SP3在25℃温度、0.1mmol/LIPTG诱导时有较为明显的上清蛋白表达。通过FLAG标签蛋白的单克隆抗体对原核表达的PAP-SP3进行Westernblot验证，结果与SDS-PAGE一致，然后对大量表达的蛋白进行Ni2+柱纯化，结果在洗脱液1(Elution1)中获得了HMsbT-PAP-SP3重组蛋白。采用测定PAP蛋白的酰胺酶活测定方法，以乙酰基-异亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-精氨酸-对硝基苯胺（acetyl-Ile-Glu-Ala-Arg-p-nitroanilide，IEARpNa）为底物进行了表达产物酶活的初步测定。其中PAP、PAP-SP1、PAP-SP2分别以含有重组质粒的表达菌株在无IPTG诱导和0.1mmol/LIPTG诱导下，破碎细菌后对菌液上清进行酶活测定，结果表明均有活性，分别为139.2U/mg、1853.1U/mg、1743.3U/mg，但无IPTG诱导下的菌液上清也有蛋白活性，分别为25.0U/mg、1573.6U/mg、568.7U/mg，诱导前后菌液上清蛋白的比活力无显著差异(P＞0.05)。对纯化获得的HMsbT-PAP-SP3重组蛋白PAP-SP3进行活性测定，结果显示其比活力为1135.1U/mg。以上结果表明:我们已成功获得PAP蛋白及其SP结构域的表达产物，且纯化获得HMsbT-PAP-SP3具有较高的比活力重组蛋白。
　　 (3)为研究细菌（大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）注射对亚洲玉米螟幼虫体内PAP基因转录水平的影响，对玉米螟幼虫进行生理盐水、革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌注射，并通过RealtimePCR检测注射后不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、36h)PAP基因在不同组织（血细胞、脂肪体、中肠、体壁）中的表达变化。结果表明:亚洲玉米螟血细胞中PAP基因的表达只在大肠杆菌注射后有显著的变化，4h时剧烈上升达到了115.3±23.2倍，随后又急剧下降，而在其他诱导物诱导后无显著变化(P＞0.05)。脂肪体中PAPmRNA的表达整体上变化不显著(P＞0.05)。在中肠中，枯草芽孢杆菌注射处理与对照组相比PAPmRNA的表达有明显差异(P＞0.05)，并随时间变化有上升的趋势，在36h时PAPmRNA表达量最高，达到了107.6±7.2倍，其他处理组无显著变化(P＞0.05)。在体壁中，不同的注射处理与对照组相比PAPmRNA的表达均有一定程度的升高，其中枯草芽孢杆菌处理组表达最为明显，在12h时PAPmRNA表达量达到了对照组的105.2±1.6倍，生理盐水处理组在8h达到了36.4±0.5倍，大肠杆菌处理组在36h时也达到了21.3±0.3倍。

目录

摘要

综述

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 总RNA提取

2．5 cDNA第一链的合成

2．6 玉米螟PAP基因中间片断扩增

2．7 PAP基因的3'-RACE

2．8 PAP基因的5'-RACE

2．9 序列的生物信息学分析

2．10 PAP重组蛋白原核表达探索

2．11 PAP-SP重组蛋白原核表达探索

2．12 PAP的酶活测定

2．13 PAP基因表达的Real time PCR检测

3 结果与分析

3．1 玉米螟PAP基因中间片断克隆

3．2 玉米螟PAP基因RACE

3．3 PAP全长基因的克隆

3．4 PAP全长基因的生物信息学分斩

3．5 PAP全长的原核表达

3．6 PAP-SP1，PAP-SP2的原核表达

3．7 PAP-SP3的原核表达

3．8 PAP原核表达产物的酶活性测定

3．9 亚洲玉米螟PAP基因表达水平的研究

4 讨论

4．1 PAP的序列及蛋白结构分析

4．2 PAP的原核表达、纯化及酰胺酶活测定

4．3 PAP丝氨酸蛋白酶结构域的研究

4．4 两种RACE策略的比较

4．5 细菌注射对PAP转录水平表达的影响

参考文献：

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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