亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée酚氧化酶原的原核表达和性质分析

摘要

昆虫体内酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)是一种重要的天然免疫蛋白，参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系，大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白，可用于各种酚氧化酶(PO)抑制剂的筛选，从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis5龄幼虫体内克隆获得的PPO基因，构建pET-28b-PPO原核表达载体，在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白，进行了Westem杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子(Mg2+，Cu2+和Fe2+)对PPO二级结构的影响。研究结果如下:
　　(1)为了PPO全长表达载体的构建。根据玉米螟幼虫PPO的cDNA全长序列，设计一对特异性表达引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，在预计大小2686 bp取得了目标条带，克隆测序验证了基因序列的准确性和完整性，表明取得了Of-PPO片段。将取得的Of-PPO片段进行割胶回收，然后与pMD18-T载体连接，连接产物转化TOP1O菌株，涂板后挑取阳性克隆菌液，并进行菌落PCR鉴定，成功获得了pMD18-T-PPO克隆载体。对鉴定后扩增的Of-PPO克隆载体的菌液进行质粒DNA的提取，将pET-28b空载体和pMD18-T-PPO分别用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，分别切取目标片段大小，将酶切产物进行回收连接，连接产物转化E coli RIL BL21(DE3)感受态细胞，进行挑斑鉴定:挑取3-5个菌株，进行菌落PCR验证，最终获得了目标大小片段的条带，完成了pET-28b-PPO表达载体的构建。预测的重组蛋白分子量为75 kDa。
　　(2)pET-28b-PPO的重组表达。在16℃条件下，将含有重组质粒的大肠杆菌表达菌株E coli BL21分别经过0.4mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L、0.025 mmol/LIPTG的梯度诱导过夜。从SDS-PAGE结果来看，重组表达的蛋白分子的大小与预测分子量大小一致，与对照（无IPTG诱导）相比，重组蛋白在75 kDa处有表达，但主要在沉淀中表达，上清中与对照（无IPTG诱导）也有一定的表达量。
　　(3)融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃，最适pH为7.2，以L-DOPA为底物时PO催化反应的Vmax为140.8 U/mg.min，Km为2.96 mmol/L。Fe2+存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7％±4.6％，α-螺旋结构成分则显著下降至2.6％±1.2％(P＜0.05);有Mg2+存在的情况下，重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降，α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu2+存在的情况下，重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0％±1.6％，而α-螺旋结构成分则上升至35.3％±6.9％。结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 昆虫的免疫防卫系统

2 昆虫的体液免疫

3 酚氧化酶参与的防御反应

4 酚氧化酶的分子结构

5 酚氧化酶的功能

6 酚氧化酶原的激活

7 研究的目的和意义

参考文献

第二章 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée酚氧化酶原的原核表达和性质分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 血清的收集

2．5 总RNA提取

2．6 感受态细胞的制备(CaCl2法)

2．7 cDNA第一链的合成

2．8 玉米螟PPO全长表达载体的构建

2．9 重组表达

2．10 PPO大量表达与融合蛋白的纯化

2．11 重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度和pH

2．12 重组PPO蛋白激活为PO后的酶动力学分析

2．13 金属离子对重组蛋白PPO的二级结构的影响

2．14 蛋白质浓度测定

2．15 数据分析

3 结果与分析

3．1 亚洲玉米螟幼虫PPO全长基因原核表达载体的构建

3．2 pET-28b-Of-PPO原核表达条件的筛选

3．3 Of-PPO重组蛋白的纯化SDS-PAGE鉴定

3．4 亚洲玉米螟重组融合PPO蛋白的Western blotting鉴定

3．5 亚洲玉米螟重组PPO蛋白激活为PO后的最适反应温度和pH

3．6 亚洲玉米螟重组蛋白PPO激活为PO后的酶动力学分析

3．7 金属离子对亚洲玉米螟重组PPO蛋白的二级结构的影响

4 讨论

4．1 PPO的蛋白结构及其功能分析

4．2 构建PPO原核表达体系的意义

4．3 原核表达条件的优化

4．4 PPO底物特异性

4．5 PPO二级结构与活性

4．6 国内外PPO体外表达纯化与天然纯化对比

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

附录

声明