pCD86:RAE-1ε转基因小鼠CD4+NKG2D+T细胞的生物学特性研究

摘要

树突状细胞(DC)作为机体重要的一种专职抗原递呈细胞(APC)，能有效活化初始T细胞。NK细胞可通过其表面NKG2D受体结合表达于DC表面的NKG2D配体。NK-DC之间的对话不仅影响天然免疫的功能，对获得性免疫的形成、发展及结果有深远的影响。为研究DC持续表达NKG2D配体对NK细胞免疫功能的影响，课题组前期制备了pCD86∶RAE-1ε转基因小鼠，并完成转基因小鼠的筛选鉴定与免疫功能的初步分析，发现转基因小鼠体内NK细胞表面NKG2D下调、免疫功能低下的同时，CD4+T细胞表面NKG2D表达上调。本研究拟进一步探讨转基因小鼠体内NK细胞表面NKG2D下调的机制，并对转基因小鼠体内异常增多的CD4+NKG2D+T细胞亚群的功能及其表型特征进行深入研究。
　　研究内容分为2部分:
　　1.pCD86∶RAE-1ε转基因小鼠体内NKG2D介导的NK细胞功能分析
　　目的:观察pCD86∶RAE-1ε转基因小鼠体内NKG2D介导的免疫功能变化，探讨体内NK细胞NKG2D表达下调的机制。
　　方法:首先利用免疫荧光技术检测转基因小鼠的肝、肾、胸腺、肺、肠等组织中I-A/I-E细胞表达RAE-1ε的情况，基于流式细胞术分析转基因小鼠脾脏内各免疫细胞表面RAE-1ε的表达。其次分析转基因小鼠脾脏NK细胞的频率及其NKG2D表达的情况，利用CD107a标记法检测NK细胞对Ba/F3、Ba/F3-RAE细胞的杀伤活性;并体内观察转基因小鼠体内B16BL6-MICA、B16BL6细胞生长的情况，右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导肠炎发病的情况。另外，体外将转基因小鼠DC细胞、血清分别与正常小鼠NK细胞共培养，观察NK细胞表面NKG2D表达的变化。最后检测转基因小鼠CD4+T、CD4+NKG2D+T细胞的频率，观察CD4+NKG2D+T细胞膜表面是否表达TGF-β，并将CD4+NKG2D+T细胞与正常小鼠NK细胞共培养，检测NK细胞NKG2D的表达。
　　结果:转基因小鼠胸腺、肠道组织、肝脏内检测到I-A/I-E与RAE-1ε共表达的细胞，脾脏CD11c+、CD11b+、CD19+、Gr-1+细胞上调RAE-1ε的表达，而NK1.1+、CD3+细胞无RAE-1ε的表达。与对照小鼠相比，转基因小鼠脾脏NK细胞的频率无明显变化，但NKG2D表达下调至中等程度水平，NK细胞杀伤Ba/F3-RAE细胞的活性下降，而杀伤Ba/F3细胞的能力无明显变化。转基因小鼠体内B16-MICA细胞的生长速度快于对照小鼠，而B16细胞的生长速度在2种小鼠间无明显区别。DSS处理的转基因小鼠延缓了肠炎的发病。转基因小鼠来源的DC细胞体外刺激NK细胞5天后，上调NK细胞功能，而对NKG2D的表达无明显影响。转基因小鼠来源的血清对NK细胞表达NKG2D无影响。转基因小鼠脾脏CD4+T细胞频率无明显变化，而CD4+NKG2D+T细胞的频率明显上调。CD4+NKG2D+T细胞膜表面表达TGF-β，与NK细胞共培养后下调NKG2D的表达。
　　结论:pCD86∶RAE-1ε转基因小鼠体内出现异常增多的CD4+NKG2D+T细胞，其分泌TGF-β介导NK细胞下调表达NKG2D，并下调NKG2D介导的免疫功能。
　　2.pCD86∶RAE-1ε转基因小鼠体内CD4+NKG2D+T细胞的生物学特性研究
　　目的:深入分析CD4+NKG2D+T细胞的效应功能及表型特点，探讨CD4+NKG2D+T细胞体外和体内的诱生机制，并初步鉴别CD4+NKG2D+T细胞与经典调节型T细胞(Treg)、Th17细胞的生物学特点。
　　方法:首先观察正常小鼠CD4+T细胞过继输入至小鼠体内，其细胞表面NKG2D表达的变化。其次，通过胞内细胞因子法流式细胞术检测转基因小鼠、CT-26细胞荷瘤小鼠、对照小鼠体内CD4+NKG2D+T细胞分泌IL-10、TGF-β、FasL、IFN-γ的情况;并将CD4+NKG2D+T细胞与CD4+NKG2DT细胞、CD8+T细胞共培养，观察其抑制效应性T细胞增殖的情况;观察CD4+NKG2D+T细胞胞浆内颗粒酶B、穿孔素的表达，及其杀伤靶细胞活性。另外，检测CD4+NKG2D+T细胞表面CD44、CD62L的表达分析该细胞的活化状态，检测其表面CD69、CD127、CD25、I-A/I-E、NKG2DL、CD28、CD152的表达。基于体外细胞实验，观察不同刺激剂诱导CD4+T细胞表面NKG2D的表达，并观察不同刺激剂对CD4+NKG2D+T细胞分裂的影响;基于小鼠体内B16-MICA、B16细胞荷瘤实验，体内观察肿瘤细胞表面MICA的表达对CD4+NKG2D+T细胞的影响。最后检测CD4+NKG2D+T细胞表达Foxp3、CD223、CD39，分泌IL-17A和RORγt的转录情况，以与Treg和Th17细胞相鉴别。
　　结果:正常小鼠CD4+T细胞输入转基因小鼠后，明显上调了NKG2D的表达。转基因小鼠、CT-26荷瘤小鼠体内的CD4+NKG2D+T细胞表达FasL、高分泌TGF-β、IL-10，体外可抑制CD4+NKG2D-T细胞和CD8+T细胞增殖，胞浆内无颗粒酶、穿孔素分泌，无细胞毒活性，低分泌IFN-γ。CD4+NKG2D+T细胞以效应记忆型细胞为主，高表达CD69、CD25、I-A/I-E、NKG2DL等活化分子。NKG2D在CD4+T细胞的诱导表达主要与TCR-CD3信号及NKG2DL的持续刺激有关，MICA阳性肿瘤细胞荷瘤小鼠体内CD4+NKG2D+T细胞的频率明显高于MICA阴性肿瘤细胞荷瘤小鼠。CD4+NKG2D+T细胞胞浆内无Foxp3转录，细胞表面无CD223表达，高水平表达CD39分子。另外，CD4+NKG2D+T细胞可中等程度分泌IL-17A，胞浆内低水平转录核因子RORγt。
　　结论:pCD86∶RAE-1ε转基因小鼠、CT-26荷瘤小鼠体内均出现一群CD4+NKG2D+T细胞，该T细胞亚群主要分泌IL-10、TGF-β和sFasL，发挥免疫调节功能。CD4+NKG2D+T细胞是不同于Treg细胞的一种调节CD4+T细胞亚群。MICA阳性肿瘤个体内诱生的CD4+NKG2D+T细胞可能参与了肿瘤免疫逃逸过程。