APP转基因小鼠神经干细胞的生物学特性及人参皂苷Rb1的治疗作用研究

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以记忆减退、认知障碍以及人格改变等为临床特征的进行性痴呆，以大脑皮层和海马区域出现老年斑（senile plaques，SP）、神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangle，NFT）和营养不良性轴突的改变为病理特征的老年神经变性。SP由β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）在细胞外沉积造成，NFT主要成分是过度磷酸化的微管相关蛋白tau。Aβ沉积和tau蛋白异常磷酸化是导致AD神经元丧失及产生痴呆症状的重要因素。但是这些病理变化常常在患者死亡后尸体解剖才得以证实，而在患者的青年时期或发病早期神经系统的病变机制尚不清楚，也使得AD患者难以进行早期治疗和疗效欠佳。
　　 阿尔茨海默病的患病率随年龄增长而上升，且有明显的遗传倾向。资料显示，大约30％的阿尔茨海默病患者有家族遗传性（称为家族性阿尔茨海默病，FAD），提示AD的发病是一个漫长的渐变过程。但在这个过程中，神经细胞的生长发育特点和病理改变十分不清，尤其是那些携带有致病基因的神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）、神经细胞的发育和生长的生物学特性尚待研究。
　　 利用人脑NSCs或神经细胞来研究不同发育时期AD的病理特征和治疗方案不仅取材困难，而且受着伦理道德的限制。复制AD的转基因动物模型，可以很好地克服这些问题。目前国际公认APP转基因小鼠是最佳AD动物模型。APP转基因小鼠是根据分子遗传学和胚胎学理论和技术，利用显微注射的方法将 APP基因片段整合入小鼠的基因组中，使得小鼠脑内表达人淀粉样前蛋白（amyloidprecursor protein，APP）基因，通过APP蛋白在大脑中过量表达，导致AB产生增加，产生老年斑，从而造成小鼠老年性痴呆转基因模型。该模型为研究APP代谢、AD的发生和发展及药物对发病进程的干预提供了良好的研究基础。
　　 抑制Aβ沉积和tau蛋白异常磷酸化是治疗AD最根本的措施之一。目前AD的传统治疗措施主要采用作用于胆碱能系统的药物、雌激素、神经营养因子、非甾体抗炎药、抗氧化剂、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体拮抗剂、抗Aβ药物、改善脑代谢的药物等，但对AD均无满意的效果。我们推测这可能至少有两方面的原因：一是AD的发病机制尚需进一步的探讨，二是需要探索新的治疗药物和治疗时机。虽然已有报道表明，乙酰胆碱等神经递质的变化在AD的发病过程中起重要作用、但是中枢众多的递质改变尚不清楚，尤其是氨基酸类中枢递质和组胺递质在AD中的变化无人研究。因此，本研究首先采用 APP转基因小鼠作为研究对象，通过在体内外的研究探索APP转基因小鼠在发育过程中，神经细胞的生长发育特征和中枢氨基酸类神经递质、组胺的动态变化，进一步揭示AD的发病机制。
　　 中药具有多途径、多靶点、多层次的整合效应，结合现代药理学的优势可能为治疗AD找到的有效药物。人参皂苷Rb1是人参和西洋参的主要成分之一，具有广泛的生理活性和药用价值，具有促智、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用，尤其是在改善学习记忆能力和保护神经方面有很好的作用。本实验室前期的体外实验中证实人参皂苷Rb1可以改善Aβ25-35导致的 Tau蛋白过磷酸化，也有一些研究报道了人参皂苷Rb1对Aβ生成、代谢的影响，但所采用的AD模型大多为铝制剂、半乳糖、Aβ等诱导，不仅不能较好地模拟体内病理改变，而且还缺乏系统研究，尤其是对氨基酸类中枢递质和组胺递质的影响未见报道。因此，本研究在APP转基因小鼠体内实验中，探索了Rb1对AD动物行为学、病理学和神经递质表达的综合治疗作用，以期为AD的治疗寻求一条有效的途径。
　　 第一部分 APP转基因小鼠神经干细胞的体外培养及其生物学特性研究。
　　 第二部分人参皂苷Rb1对体外培养APP转基因小鼠神经干细胞的影响及机制研究。
　　 第三部分 APP转基因小鼠发病过程中脑内神经递质和组织病理学特征的研究。
　　 第四部分人参皂苷Rb1对APP转基因小鼠的治疗作用和机制研究。
　　 结论:
　　 1.APP高表达不影响体外培养的NSCs的生长速度和细胞形态，但可引起NSCs诱导分化后的总Tau的表达量增高，细胞凋亡率增高，APP+新生鼠神经干细胞可作为AD发病机制和抗AD药物筛选研究的理想细胞模型。
　　 2.人参皂苷Rb1降低体外培养的APP+鼠NSCs分化细胞的Tau蛋白396和262位点的磷酸化水平，人参皂苷Rb1可上调GSK-38的表达和下调PP2A的表达而影响Tau蛋白磷酸化水平。
　　 3.APP+鼠的中枢神经递质含量和酶表达量与APP-鼠存在明显差异，表现在：APP+鼠中枢组胺含量和HNMT表达量明显升高；APP+鼠AchE活性明显低于APP-鼠，不同月龄APP+鼠AchE活性不同（6和12月龄较低，9月龄较高）；氨基酸类递质谷氨酸（Glu），γ-氨基丁酸（GABA），牛磺酸含量无明显变化，APP+鼠甘氨酸（Gly）含量明显高于APP-鼠。
　　 4.人参皂苷Rb1可改善APP模型小鼠的学习记忆能力；降低APP+组脑内APP、AB1-24含量和淀粉样沉淀；降低海马总Tau蛋白和Tau[pS396]、Tau[pS262]的表达；降低AchE活性：降低海马内Gly的含量。

目录

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论文说明：英文缩略词索引

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引言

第一部分体外培养的APP转基因小鼠神经干细胞的生物学特性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

照片

第二部分人参皂苷Rb1对体外培养APP转基因小鼠神经干细胞的作用及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

照片

第三部分APP转基因小鼠发病过程中脑内神经递质和组织病理学特征的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

照片

第四部分人参皂苷Rb1对APP转基因小鼠的治疗作用和机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

照片

参考文献

综述 阿尔茨海默病的干细胞移植治疗与中药治疗的现状

攻读学位期间发表的论文

致谢